Главная » 2014 » Июль » 29 » Скачать Взаимодействие негистонового хромосомного белка HMGB1 с ДНК, роль ДНК-связывающего и С-концевого доменов HMGB1 в формировании бесплатно
8:58 PM
Скачать Взаимодействие негистонового хромосомного белка HMGB1 с ДНК, роль ДНК-связывающего и С-концевого доменов HMGB1 в формировании бесплатно
Взаимодействие негистонового хромосомного белка HMGB1 с ДНК, роль ДНК-связывающего и С-концевого доменов HMGB1 в формировании ДНК-белковых комплексов
Диссертация
Автор: Поляничко, Александр Михайлович
Название: Взаимодействие негистонового хромосомного белка HMGB1 с ДНК, роль ДНК-связывающего и С-концевого доменов HMGB1 в формировании ДНК-белковых комплексов
Справка: Поляничко, Александр Михайлович. Взаимодействие негистонового хромосомного белка HMGB1 с ДНК, роль ДНК-связывающего и С-концевого доменов HMGB1 в формировании ДНК-белковых комплексов : диссертация кандидата физико-математических наук : 02.00.06 Санкт-Петербург, 2003 182 c. : 61 03-1/1062-4
Объем: 182 стр.
Информация: Санкт-Петербург, 2003
Содержание:
Глава 1 Обзор литературы
1 Современные представления о структуре хроматина
11 Нуклеосомная организация хроматина
12 30-нм фибриллы
13 Высшие уровни структурной организации хроматина
2 Негистоновые белки хроматина семейства HMG
21 Белки семейства HMGB1/
22 Структура белка HMGB
23 Белки, содержащие HMGB-домены
24 Расположение в хроматине и взаимодействие с ДНК
25 Функции белков, содержащих HMGB-домены
Глава 2 Методы исследования и материалы
1 Аналитическое ультрацентрифугирование
11 Расчет коэффициента седиментации
12 Методика эксперимента
2 Спектроскопия ультрафиолетового диапазона
21 УФ-спектроскопия
22 Спектроскопия кругового дихроизма
221 Определение структуры полипептидов по спектрам КД
222 Определение структуры ДНК на основе анализа спектров КД
223 Методика эксперимента
23 Флуоресцентная пектроскопия
3 Спектроскопия инфракрасного диапазона
31 ИК-спектроскопия
32 Вибрационный круговой дихроизм
33 Применение ИК спектроскопии в исследовании структуры биополимеров
331 Определение структуры полипептидов
332Определение структуры нуклеиновых кислот
3321 Колебания аминогруппы оснований
3322 Колебания кратных связей в основаниях
3323 Колебания сахарофосфатного остова
333Методика эксперимента
4 Сканирующая силовая микроскопия
5 Получение препаратов и формирование искусственных комплексов
51 Выделение плазмидной ДНК
52 Получение белков
53 Формирование ДНК-белковых комплексов
Глава 3 Компактизация ДНК при взаимодействии с негистоновым белком HMGB
1 Седид1ентация и оптическая активность комплексов рДНК-HMGB
2 Комплексы белка HMGB1 с высокомолекулярной ДНК
21 Оптическая активность комплексов ДНК-HMGBl
22 Флуоресцентные свойства ДНК-белкового комплекса
23 Колебательные спектры комплексов ДНК-HMGBl
24 Визуализация комплексов методом ССМ
3 Выводы к главе
Глава 4 Влияние ионов металлов на компактизацию комплексов HMGBl-ДНК
2 Действие ионов кальция на свойства ДНК-белкового комплекса
21 Комплексы Са^^-ДНК
22 Комплексы HMGBl-ДНК-Са^^
3 Ионы марганца
31 Комплексы Мп^^-ДНК
32 Комплексы НМСБ1-ДНК-Мп^^
33 Заключение
4 Выводы к главе
Глава 5 Взаимодействие ДНК с рекомбинантпым белком HMG1-(A+B)
51 Взаимодействие НМ01-(А+В)-ДНК в условиях различной ионной силы
511 Низкая ионная сила (15 мМ NaCl)
512 Высокая ионная сила (150 мМ NaCl)
513 Заключение
52 Влияние ионов Са на формирование высокоупорядоченных комплексов
53 Заключение
54 Выводы к главе
Глава 6 Взаимодействие HMGB1 с ДНК в присутствии гистоиа HI
62 Взаимодействие ДНК с белками HMGB1 и HI в растворах MMNaCl
63 Поведение ДНК-белковых комплексов в присутствии ионов Мп^*
631 Оптическая активность тройного комплекса
632 Характеристика колебательных переходов системы ДНК-Hl-HMGBl-Mn^^
633 Обсуждение
64 Выводы к главе
Введение:
Изучение механизмов взаимодействия молекул биологических полимеров находится в центре внимания современной биофизики. Одним из наиболее важных вопросов в этой области, как с теоретической, так и с прикладной точек зрения, являются ДНК-белковые взаимодействия. Структурные изменения в молекуле ДНК играют ключевую роль в функционировании генетического материала живой клетки. В то же время, ДНК является жёсткой полимерной молекулой, механизмы нарушения структуры которой представляют интерес для полимерной науки. По существующим на сегодняшний день представлениям негистоновые белки хроматина участвуют в широком спектре структурных взаимодействий с ДНК. Особая роль в таких взаимодействиях принадлежит белкам семейства HMGB, для всех членов которого характерно наличие общего структурного HMGB-мотива (High Mobility Group Box) в составе белков семейства. Эти белки составляют наиболее распространённую ^)ракцию негистоновых белков хроматина. Все они обладают ярко выраженной ДНК:взывающей активностью, обусловленной присутствием HMGB-доменов. Однако |)ункциональная роль самих белков семейства до сих пор остаётся неясной. По всей видимости, они выполняют архитектурную функцию в составе хроматина, являясь некими структурирующими элементами ДНК-белкового комплекса. Несмотря на то, что за юследние годы бьшо получено большое количество данных о структуре комплексов полированных HMGB-доменов с короткими фрагментами ДНК (до 12 н.п.), остаётся 1ерешённым вопрос о механизмах формирования и устройстве комплексов молекул целого )елка с протяжёнными участками двойной спирали. В связи с этим, возникает необхо[имость как в изучении взаимодействия белка с ДНК большого молекулярного веса, так и в становлении роли отдельных частей белковой молекулы во взаимодействии такого рода.Молекулы белка HMGB1 обладают ярко-выраженной доменной организацией, :оторая включает в себя помимо двух HMGB-доменов, неупорядоченный С-концевой )рагмент, содержащий непрерывную последовательность из 30 дикарбоновых аминокислот, :, как следствие, несущий на себе значительный отрицательный заряд. Такое устройство елка ставит вопрос о взаимном влиянии его отдельных доменов друг на друга при заимодействии с другими молекулами в растворе. Вопрос о взаимодействии отдельных [НК-связывающих доменов белка с высокомолекулярной ДНК в настоящее время также стаётся неизученным. В то же время их структурная консервативность и широкая аспространённость позволяют предполагать универсальность воздействия HMGB-доменов азличных белков на ДНК. Одним из важных параметров, влияющих на характер связывания заряженных олимеров является ионная сила и ионный состав растворителя. Исследования последних лет оказали, что наиболее интересны, с точки зрения функционирования комплексов HMGB1НК, являются ионы Са и Мп . Однако молекулярные механизмы ДНК-белковых взаимодействий и структура комплексов, формирующихся в присутствии этих ионов, остаются на сегодняшний день не изученными.Существенным препятствием на пути изучения структуры ДНК-белковых комплексов в растворе является ограниченный диапазон молекулярных весов систем, исследуемых методом ядерного магнитного резонанса. В связи с этим наиболее перспективным остаётся использование спектроскопических методов, и в частности, спектроскопии кругового дихроизма (КД). Относительная простота и удобство в применении делают эти методы весьма полезными при изучении структуры полимерных молекул и их комплексов.Цел.и и задачи исследования.Целью данной работы являлось изучение механизмов взаимодействия высокомолекулярной ДНК с негистоновым белком HMGB1, в том числе, исследование характера взаимодействия отдельных функциональных доменов белка в условиях различной ;юнной силы и ионного состава; изучение характера компактизации ДНК в указанных условиях; роль ионов Са и Мп в формировании ДНК-белковых комплексов; определение .'словий формирования упорядоченных надмолекулярных структур в системе ДНК-HMGB. В ;оответствии с целями исследования были поставлены следующие задачи: 1. Методами кругового дихроизма и абсорбционной спектроскопии в ультрафиолетовой и инфракрасной областях спектра определить особенности вторичной и третичной структуры комплексов HMGB-ДНК.
2. Используя гидродинамические и спектральные методы, а также метод сканирующей силовой микроскопии определить характер взаимодействия белка HMGB1 и его отдельных доменов с высокомолекулярной ДНК в зависимости от ионной силы среды.3. Изучить влияние ионов Са и Мп на ход комплекообразования и структуру ДНКбелковых комплексов.4. Установить характер связывания белка HMGB1 с ДНК в присутствии линкерного гистона HI; определить влияние гистона HI на структуру формирующегося комплекса.Усновные положения, выносимые на защиту: 1. Взаимодействие негистонового хромосомного белка HMGB1 с ДНК представляет собой двухстадийный процесс. Начало каждой из фаз взаимодействия определяется в основном соотношением белок : ДНК в системе и ионной силой раствора.2. ДНК-связывающая способность белка HMGB1 зависит не только от свойств HMGBдоменов, но также модулируется активностью неупорядоченного С-концевого домена.3. Присутствие ионов Са^^ и Мп "^ оказывает влияние на ход взаимодействия ДНК с белком HMGBl, вызывая нарушения структуры комплексов, отличные от эффекта повышения ионной силы растворителя.4. Одновременное взаимодействие с ДНК HMGB-белков и гистона HI не носит конкурентного характера. Оно стимулирует формирование в растворе упорядоченных надмолекулярных структур. Ход этого процесса зависит от присутствия в среде ионов двухвалентных металлов.Научная новизна и научно-практическая ценность работы.В рамках данной работы была экспериментально показана возможность параллельного использования методов инфракрасной (ИК) и ультрафиолетовой (УФ) спектроскопии для изучения ДНК-белковых комплексов. Были впервые получены и проанализированы спектры оптической активности в ИК диапазоне (вибрационный круговой цихроизм - ВКД) систем, содержащих белок HMGB1. Нами, также впервые, была эсуществлена прямая визуализация комплексов HMGB-ДНК в растворе методом сканирующей силовой микроскопии.В ходе исследования была показана возможность формирования зысокоупорядоченных надмолекулярных структур ДНК под влиянием HMGB-белков.Остановлено, что взаимодействие HMGB1 с ДНК проходит в два этапа. На первом этапе при ^алых соотношениях белок/ДНК доминирующая роль в формировании комплекса финадлежит ДНК-белковому взаимодействию. При этом взаимодействующие компоненты фетерневают конформационные превращения: увеличивается степень а-спиральности ДНКвязывающего домена белка HMGB1, а ДНК претерпевает локальные изменения, ;ызывающие ее компактизацию. Увеличение содержания белка в комплексе сопровождается [среходом к кооперативным взаимодействиям HMGB1 с ДНК, характеризующимся ильными белок-белковьми взаимодействиями. Этот второй этап связывания HMGB1 с ДНК тличается качественными перестройками структуры комплекса. Образующиеся при этом в авновесньк условиях комплексы характеризуются меньшим числом центров ДНКелкового взаимодействия, каждый из которых представляет собой локальный сложный [НК-белковый комплекс, формирующийся под воздействием белок-белковых заимодействий.В работе показано, что ионы двухвалентных металлов Са^ ^ и Мп^ "^ оказывают у'щественное и различное влияние на ход взаимодействия ДНК с белком HMGB1. становлено, что действие этих ионов отлично от эффекта увеличения ионной силы 1створителя и приводит к нарушению локальной структуры ДНК-белковых комплексов, этя влияние каждого из этих ионов имеет свою специфику.Для анализа роли отдельных доменов негистонового белка HMGB1 в образовании его )мплексов с ДНК, в работе был использован рекомбинантный белок HMG1-(A+B), 1шенный анионной С-концевой последовательности нативного белка HMGB1. Комплексы этого рекомбинантного белка с ДНК обладали необычно высокой степенью структурной упорядоченности, что проявлялось в их аномально высокой оптической активности. Эти данные достаточно убедительно свидетельствуют о том, что неструктурированный Сконцевой домен молекулы HMGB1 может обладать функцией регулятора активности не только белок-белковых, но и ДНК-белковых взаимодействий.Полученные в работе результаты важны для понимания связи между свойствами полимерных молекул белка HMGB1 и ДНК, структурой их комплексов и функционированием хроматина в живой клетке. На основании полученных результатов предложены модели возможного воздействия на ДНК со стороны белков, содержащих два и более HMGB-доменов, объясняющие некоторые особенности строения и функционирования таких белков.Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на 5-й Всероссийской конференции студентов-физиков и молодых ученых (Екатеринбург, 1999 г. Диплом I [Степени), II Съезде биофизиков России (Москва, 1999 г), XIII Всероссийском симпозиуме 'Структура и функции клеточного ядра" (С-Петербург, 1999 г), Школе-конференции 'Горизонты физико-химической биологии" (Пущино, 2000 г), Международной конференции 10 проблемам конформации, модификаций и узнавания ДНК в биомедицине (Брно, 2000), Международной конференции по структуре и взаимодействию ДНК (Брно, 2000), 3-м европейском биофизическом конгрессе (Мюнхен, 2000), Всероссийском симпозиуме :Клеточная биология на пороге XXI века» (Санкт-Петербург, 2000), конференции студентов [ аспирантов (Санкт-Петербург, 2000), 7-ой Всероссийской конференции студентов-физиков [ молодых учёных (Санкт-Петербург, 2001. Диплом I Степени), 5-ой Пущинской онференции молодых учёных (Пущино, 2001. Диплом II Степени), Открытом юбилейном еминаре кафедры молекулярной биофизики СПбГУ (Санкт-Петербург, 2001), '1еждународной конференции "ДНК в хроматине: на стыке биологии, биофизики и еномики" (Аркашоп, Франция, 2002), 6-й Пущинской школе-конференции молодьк ученых Биология-Наука XXI века" (Пущино, 2002), XIV Международном биофизическом конгрессе эуэнос-Айрес, 2002), 6-м Международном симпозиуме по биоорганической химии (ICBC-6, оронто, 2002), 6-й Европейской конференции по бионеорганической химии (EUR0BIC-6, 'опенгаген, 2002).По теме работы опубликовано 5 статей в реферируемых российских и зарубежных аучных журналах.Диссертация изложена на 182 страницах, содержит 59 рисунков и 4 таблицы. Список ;1тируемой литературы включает 266 наименований.
