Главная » 2014 » Август » 4 » Скачать Свойства и регуляция активности 6-фосфоглюконатдегидрогеназы в условиях оксидативного стресса при токсическом поражении печени бесплатно
11:13 PM
Скачать Свойства и регуляция активности 6-фосфоглюконатдегидрогеназы в условиях оксидативного стресса при токсическом поражении печени бесплатно
Свойства и регуляция активности 6-фосфоглюконатдегидрогеназы в условиях оксидативного стресса при токсическом поражении печени крыс
Диссертация
Автор: Свиридов, Максим Михайлович
Название: Свойства и регуляция активности 6-фосфоглюконатдегидрогеназы в условиях оксидативного стресса при токсическом поражении печени крыс
Справка: Свиридов, Максим Михайлович. Свойства и регуляция активности 6-фосфоглюконатдегидрогеназы в условиях оксидативного стресса при токсическом поражении печени крыс : диссертация кандидата биологических наук : 03.00.04 Воронеж, 2006 150 c. : 61 07-3/266
Объем: 150 стр.
Информация: Воронеж, 2006
Содержание:
1 ВВЕДЕНИЕ
Глава
I Обзор литературы
11 Развитие оксидативного стресса в гепатоцитах
12 Образование активных форм кислорода в клетках печени
13 Свободнорадикальное окисление биомолекул
14 Роль свободных радикалов нри патологии
15 Антиоксидантная защита организма
16 Влияние низкомолекулярных антиоксидантов на свободнорадикальное окисление
17 Глутатион регулятор ферментативной антиоксидантной системы
18 Антиоксидантные ферменты клеток и их роль в регенерации гепатоцитов
19 Нарушение процессов метаболизма глюкозы в клетке при оксидативном стрессе
110 Функционирование пентозофосфатного пути при оксидативном стрессе
111 Токсическое повреждение печени как модель активации свободнорадикальных реакций
112 1 Механизм действия четыреххлористого углерода
113 Механизм действия гидразина
114 Общая характеристика 6-фосфоглюконатдегидрогеназы
115 Катализируемая реакция
116 Структура и молекулярная масса фермента
117 Локализация 6-фосфоглюконатдегидрогеназы 3О
118 Методы очистки 6-фосфоглюкоиатдегидрогеназы
119 Кинетические свойства 6-фосфоглюконат- дегидрогеназы и регуляция ее активности
120 Влияние концентрации субстрата и кофермента на активность 6-фосфоглюконатдегидрогеназы
121 Зависимость реакции от температуры и рН
122 Активаторы 6-фосфоглюконатдегидрогеназы
123 Ингибиторы 6-фосфоглюконатдегидрогеназы
Глава II Объект и методы исследования
21 Объект исследования
22 Создание модели интоксикации крыс четыреххлористым углеродом
23 Создание модели интоксикации крыс сульфатом гидразина
24 Получение субклеточных фракций гепатоцитов
25 Оцределение интенсивности процессов свободнорадикального окисления методом биохемилюминесценции
26 Оценка степени окислительной модификации белков
27 Определение концентрации восстановленного глутатиона
28 Определение активности ферментов
29 Определение количества белка
210 Выделение и очистка 6-фосфоглюконатдегидрогеназы из печени крыс
211 Экстракция
212 Фракционирование белков с помощью сульфата аммония
213 Гель-фильтрация на сефадексе G-
214 Ионообменная хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе
215 Концентрирование фракций фермента 6-фосфоглюконатдегидрогеназной
216 Гель-хроматография на Toyopearl HW-
217 Исследование кинетических характеристик и регуляции активности фермента
218 Аналитический электрофорез
219 Определение молекулярной массы фермента
220 Статистическая обработка результатов
Глава
III Сравнительная оценка интенсивности свободнорадикальных нроцессов и активности 6-фосфоглюконат- дегидрогеназы в динамике развития токсического поражения печени крыс Параметры биохемилюминесценции в печени и сыворотке крови крыс в динамике развития интоксикации под действием ССЦ и сульфата гидразина
31 Изменение активности аконитатгидратазы при развитии токсического поражения
32 Определение содержания карбонильных групп в белках при интоксикации крыс гепатотропными агентами
33 Изменение активности дегидрогеназ пентозофосфатного пути при развитии оксидативного стресса
Глава
IV Кинетические и регуляторные свойства 6-фосфоглюконатдегидрогеназы интоксикации CCI
41 Исследование субклеточной локализации 6-фосфо64 из печени из нечени крыс в норме и при глюконатдегидрогеназы
42 Очистка 6-фосфоглюконатдегидрогеназы контрольных и подвергнутых токсическому гепатиту крыс
43 Молекулярная масса 6-фосфоглюконатдегидрогеназы
44 Исследование кинетических параметров каталитического действия 6-фосфоглюконатдегидрогеназы в норме и при интоксикации CCU
45 Влияние концентрации ионов водорода на активность 6фосфоглюконатдегидрогеназы токсического гепатита
46 Регуляторные свойства 6-фосфоглюконатдегидрогеназы из печени крыс в норме и нри патологии
47 Участие ионов некоторых металлов активности 6-фосфоглюконатдегидрогеназы
48 Исследование регуляции активности фермента при действии пероксида водорода
49 Влияние глутатиона на скорость протекания 6-фосфоглюконатдегидрогеназной опытной групп крыс
410 Влияния нуклеотидов на активность фермента
411 Влияние ди- и трикарбоновых кислот на активность 6фосфоглюконатдегидрогеназы в норме и при интоксикации крыс реакции в печени контрольной и в регуляции в норме и при развитии ecu
412 Влияние метаболитов углеводного обмена на активность 6-фосфоглюконатдегидрогеназы из печени крыс
Глава
V Кинетические и регуляторные свойства 6-фосфоглюкоиатдегндрогеназы из печени крыс при интоксикации сульфатом гидразина
51 Очистка 6-фосфоглюконатдегидрогеназы из печени крыс при интоксикации сульфатом гидразина
52 Исследование кинетических нараметров каталитического действия 6-фосфоглюконатдегидрогеназы в норме и при интоксикации сульфатом гидразина
53 Влияние концентрации ионов водорода на активность 6-фосфоглюконатдегидрогеназы при иптоксикации сульфатом гидразина
54 Регуляторные свойства 6-фосфоглюконатдегидрогеназы из печени крыс при интоксикации крыс сульфатом гидразина
55 Участие ионов некоторых металлов в регуляции активности 6ФГДГ
56 Исследование регуляции активности фермента при действии пероксида водорода
57 Влияние глутатиона на скорость протекания 6-фосфоглюконатдегидрогеназной сульфатом гидразина
58 Влияния нуклеотидов на активность фермента
59 Влияние ди- и трикарбоновых кислот на активность 6-фосфоглюконатдегидрогеназы гидразина
510 Влияние метаболитов углеводного обмена на при интоксикации сульфатом реакции при интоксикации крыс активность 6-фосфоглюконатдегидрогеназы из печени крыс в условиях введения сульфата гидразина
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
ЛИТЕРАТУРА ИРИЛОЖЕИИЕ ПО
Введение:
Актуальность работы. Изучение молекулярных механизмов, ответственных за регуляцию и координацию обмена веществ в клетке, является фундаментальной проблемой биохимии. Исследование саморегулирования обменных процессов на уровне отдельных ферментных систем позволяет приблизиться к глубокому и детальному анализу организации метаболизма в живой клетке с выходом на более высокий организменный уровень. Однако многие аспекты регуляции клеточного метаболизма на ферментативном уровне, особенно, в условиях развития патологии, требуют дальнейших исследований. Это относится, в частности, к 6-фосфоглюконатдегидрогеназе (КФ 1.1.1.44, 6ФГДГ) ферменту, катализирующему одну из реакций пентозофосфатного пути (ПФП) окислительное декарбоксилирование 6-фосфоглюконата до рибулозо-5-фосфата. Важность изучения 6ФГДГ определяется физиологическим значением данного фермента, участвующего в образовании NADPH, необходимого для протекания многих биосинтетических реакций. Кроме того, по современным представлениям в основе патогенеза ряда заболеваний лежит дисбаланс между чрезмерным образованием активных форм кислорода (АФК) и недостаточностью антиоксидантных систем (АОС) организма [36, 183, 184]. Благодаря функционированию глутатионредуктазной/глутатионпероксидазной обеспечивается детоксикация (ГР/ГП) АОС в клетках и органических неорганического пероксидов. Уровень NADPH играет наиболее значимую роль в регуляции интенсивности функционирования данной системы. Показано участие глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г6ФДГ, КФ 1.1.1.49) в ноставке восстановительных эквивалентов в условиях оксидативного стресса [37, 109]. Данные относительно функционирования 6ФГДГ при развитии патологий, связанных с интенсификацией 8 процессов свободнорадикального окисления (СРО), весьма противоречивы [119, 125, 129]. К настоящему времени исследованы физико-химические свойства 6ФГДГ, выделенной из ряда организмов [66, 78, 139]. Однако, такой аспект, как регуляция активности фермента при реорганизации метаболизма при оксидативном стрессе остается не изученным. Исследования в этом плане могли бы способствовать выяснению роли 6ФГДГ в лимитировании процессов СРО, значительно усиливающихся при патологии. Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось исследование кинетических свойств и регуляции активности 6ФГДГ из печени крысы при оксидативном стрессе, вызванном различными гепатотоксинами. В связи с поставленной целью решались следующие задачи: 1) сравнительная оценка интенсивности протекания сободнорадикальных (СР) процессов в печени крыс в норме, при интоксикации крыс четыреххлористым углеродом и сульфатом гидразина; 2) получение высокоочищенных ферментных препаратов 6ФГДГ из печени контрольных и подвергнутых интоксикации гепатотоксинами животных; 3) исследовапие кинетических параметров каталитического действия 6ФГДГ в норме и в условиях развития оксидативного стресса, вызванного введением CCU и сульфата гидразина; 4) изучение регуляции активности фермента в норме и при введении гепатотоксинов; 5) создание гипотетической модели участия 6ФГДГ в регуляции протекания процессов в пораженной гепатотоксинами печени крыс. Научная особенностей новизна. регуляции Проведено 6ФГДГ в комплексное условиях исследование интенсификации СР процессов, инициированных введением гепатотропных веществ (CCU, сульфат гидразина). Разработаны способы выделения и получены гомогенные препараты 6ФГДГ из печени контрольных и подвергнутых интоксикации гепатотоксинами животных. Впервые дана сравнительная 9 характеристика каталитических и регуляторных свойств 6ФГДГ в норме и при токсическом поражении печени. Выявлено, что в условиях оксидативного стресса происходит снижение удельной активности 6ФГДГ, что может быть связано с модификациями механизмов метаболитной регуляции результатов функционирования сделано фермента. что в На основе полученных интоксикации заключение, условиях гепатотоксинами 6ФГДГ, по-видимому, не играет существенной роли в поставке NADPH для ГР/ГП-системы, которая может обеспечиваться другими NADPH-генерирующими ферментами в частности, Г6ФДГ и NADP-изоцитратдегидрогеназой. Предложена гипотетическая схема возможного участия 6ФГДГ в лимитировании СР процессов, путем снижения скорости образования короткоцепочечных Сахаров. Практическая значимость. Полученные данные позволяют расширить и углубить фундаментальные представления о функционировании 6ФГДГ в условиях нормы и при патологии. Исследование особенностей метаболитной регуляции 6ФГДГ в условиях оксидативного стресса, развивающегося при токсическом норажении печени, может способствовать выяснению причин патогенеза на клеточном уровне и поиску путей коррекции патологического состояния в медицинской практике. Разработанные способы получения гомогенных ферментных препаратов 6ФГДГ из печени контрольных и подвергнутых интоксикации крыс могут быть использованы для получения ферментных препаратов в производственных и лабораторных условиях, а также могут применяться в научно-исследовательской практике при выделении других ферментов из различных тканей млекопитающих, при моделировании биохимических процессов in vivo для изучения кинетики сопряженных реакций в полиферментных системах. Материалы работы используются в учебном процессе на биолого-почвенном факультете Воронежского государственного университета при чтепии курсов «Биохимия человека», «Свободно10 радикальные процессы», а также спецкурсов по аналитической клинической биохимии и энзимологии. Кроме того, материалы работы используются при проведении практикумов, выполнении курсовых и дипломных работ студентами ВГУ. Результаты работы иснользованы при выполнении гранта по научной программе «Фундаментальные исследования высшей школы в области естественных и гуманитарных наук «Университеты России» УР.07.01.004», а.также проекта по ведомственной целевой программе Министерства образования и науки РФ «Развитие научного потенциала высшей школы» РНП. 2.1.1.4429. Апробация работы. Основные результаты, полученные при выполнении диссертационной работы, представлены на 9-ой и 10-ой Пуш;инской школе-конференции молодых ученых «Биология наука 21 го века» (Пущино, 2005, 2006), III Съезде биофизиков России (Воронеж, 2004), VIII Международной проблемы научной экологической конференции систем» «Актуальные сохранения устойчивости живых (Белгород, 2004), IV Международной научно-практической конференции «Медицинская наука XXI века» (Витебск, 2004), ежегодной научной отчетной конференции преподавателей госуниверситета (Воронеж, 2005, 2006). и сотрудников Воронежского Публикации. Основные результаты диссертационной работы изложены в 8 публикациях в 3 статьях и 5 тезисах. На защиту выносятся следующие полозкения: В динамике развития (CCU, токсического поражения печени крыс гепатотоксинами сульфат гидразина), сопровождающегося интенсификацией процессов СРО и увеличением активности Г6ФДГ, наблюдается снижение удельной бФГДГ-активности, указываюш;ее на то, 11 что, по-видимому, данный фермент не играет существенной роли в генерировании NADPH для ГР/ГП АОС. С использованием гомогенных ферментных препаратов 6ФГДГ показано, что изменения при поражении печени гепатотоксинами параметров каталитического происходят действия и кинетических регуляции активности фермента под действием ионов некоторых металлов, интермедиатов цикла Кребса, метаболитов углеводного обмена и нуклеотидфосфатов. При интоксикации гепатотоксинами имеет место ряд особенностей регуляции активности 6ФГДГ, которые могут способствовать торможению функционирования фермента: возникновение ингибирующего действия окисленного глутатиона, снятие активирующего эффекта изоцитрата и NAD. Предложена гипотетическая схема, отражающая возможное участие 6ФГДГ в регуляции интенсивности протекания свободнорадикальных процессов в клетке, путем снижения концентраций короткоцепочечных Сахаров (глицеральдегид, дигидроксиацетон, эритроза, рибоза-5-фосфат), которые могут усиливать оксидативный стресс [76] и вызывать апоптоз клеток [100]. Структура и объем работы. Диссертация представлена на 150 страницах текста, состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения полученных результатов (5 глав), заключения, выводов, списка литературы и приложения. Иллюстративный материал включает 22 рисунка и 8 таблиц. В приложении содержатся 16 рисунков и 3 таблицы. 12
