Главная » 2014 » Июнь » 24 » Скачать Структурно-функциональное состояние иммуноцитов при их взаимодействии с гуморальными факторами иммунной системы в условиях бесплатно
3:52 PM
Скачать Структурно-функциональное состояние иммуноцитов при их взаимодействии с гуморальными факторами иммунной системы в условиях бесплатно
Структурно-функциональное состояние иммуноцитов при их взаимодействии с гуморальными факторами иммунной системы в условиях УФ-облучения
Диссертация
Автор: Двурекова, Евгения Александровна
Название: Структурно-функциональное состояние иммуноцитов при их взаимодействии с гуморальными факторами иммунной системы в условиях УФ-облучения
Справка: Двурекова, Евгения Александровна. Структурно-функциональное состояние иммуноцитов при их взаимодействии с гуморальными факторами иммунной системы в условиях УФ-облучения : диссертация кандидата биологических наук : 03.00.02 Воронеж, 2005 213 c. : 61 05-3/498
Объем: 213 стр.
Информация: Воронеж, 2005
Содержание:
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
ГЛАВА 1 Клетки иммунной системы, их роль в регуляции иммунологических реакций
11 Функциональные особенности клеток иммзшной системы
12 Основные рецепторы на поверхности иммуноцитов
13 Общая характеристика цитокинов Роль фактора некроза опухоли в иммунологических реакциях
14 УФ-индуцированные изменения структурного и функционального состояния иммуноцитов
ГЛАВА 2 Система комплемента: особенности строения, функциони-^ рования и регуляции активности С4 компонента ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
ГЛАВА 3 Объекты и методы исследования
31Объекты исследования
32 Методы исследования
321 Выделение лимфоцитов из крови человека
322 Полз^ение Т-лимфоцитов
323 Выделение Maiqp(K a^roB из перитонеальной жидкости мыши , 324 Получение супернатанта иммуноцитов
325 Выделение нешрофилов из крови человека
326 Получение сыворотки крови
327 УФ-облучение исследуемых образцов
328 Инкубация макрофагов с фактором некроза опухоли а
329 Метод иммуноферментного анализа для изучения процессов взаимодействия С4 фактора комплемента с мембранами иммуноцитов
3210 Метод 1Шмунофпу(^ )е(щегащи для и^чения структурных т* свойств мемб^кав иммуноцитов
3211 Определение функциональной активности С4 фактора системы комплемента методом гемолитического титрования
3212 Регистрация и анализ ПК-спектров белка С
3213 Регистрация электрошшх спектров поглощения белка С
3214 Яроведение диск-электрофореза в полиакриламидном геле белка С
3215 Измерение буферной емкости и снятие кривых титрования белка С
3216 Получение лимфоцитарных и макрофагальных лизатов для определения концентрации фактора некроза опухоли а и цитоток-сической активности макрофагов
3217 Метод иммуноферментного анализа для определения концентрации ФНОа в лизатах Т-лимфоцитов
3218 Измерение интенсивности люминолзависимой хемилюминес-ценции иммуноцитов
3219 Метод определения ТБК-активных продуктов в суспензии лимфоцитов
3220 Определение пероксидазной активности лимфоцитов
3221 Определение супероксиддисмутазной активности лимфоцитов методом люминолзависимой хемилюминесценции
3222 01феделение цитотоксической активности макрофагов
3223 Определение жизнеспособности макрофагов с помощью трипа-нового голубого
3224 Статистическая обработка результатов экспериментов
ГЛАВА 4 Влияние УФ-света на процесс взаимодействия С4 фактора системы комплемента с мембранами иммуноцитов
41 Взаимодействие С4 фактора системы комплемента с мембранами лимфоцитов и макрофагов в условиях УФО
411 Влияние УФч;вета на функциональное состояние мембраносвя-занного С
412 Влияние УФ-света на структурное состояние CR1-рецепторов с лигандироваииым С4 ^ поверхности лимфощггсж и f ма1фофагов
413 Взаимодействие фотомодифицированных им1«уноцитов с сывороточным С4 ^ ф 414 Влияние УФ-свега на гемолитическую активность белка С
415 Влияние УФ-света на структурно-функциональное состояние сывороточного С4 ,
42 Взаимодействие С4 компонента комплемента с мембранами нейтрофилов крови человека в условиях УФО
43 Определение роли фотомодификаций белка С4 и мембран имму-ноцитов в изменение антителосвязывающей способности изучаемых систем
ГЛАВА 5 Анализ УФ-индуцированных структурных модификаций С4 белка системы комплемента
51 Влияние УФ-света на ИК-спектральные характеристики С4 белка системы комплемента
52 Электронные спектры поглощения УФ-облученных растворов С
53 Электрофоретические характеристики фотомодифицированного белка С
54 Влияние УФ-света на буферную емкость растворов белка С
ГЛАВА 6 Влияние УФ-ч^ вета на некоторые функциональные свойства лимфоцигов крови человека
61 Уровень продукции фактора некроза опухоли а Т-лимфоцитами в условиях УФ-облучения
62 Изучение процессов ПФОЛ, протекающих на мембранах лимфоцитов
621 Влияние УФ-света на хемилюминесцентные свойства лимфоцитов
622 Дозовая зависимость накопления ТБК-активных продуктов в суспензии лимфоцитов в условиях УФ-облучения
63 Влияние УФ-света на ферментанивную активность лимфоцитов
631 Влияние УФч;вета на пqюкcццaзнyю активность лга|фо1Щ1Ш> f| 632 Влияние УФ-света на супдюксидцисигутазную активность лимфоцитов 1» • * ^ ^
ГЛАВА 7 Исследование сочетанного действия УФ-света и фактора некроза опухоли а на функциональную активность макрофагов
71 Изменение цитотоксической активносга макрофагов в условиях УФ-облучения
72 Исследование сочетанного действия УФч;вета и ФНОа на уровень спонтанной хемилюминесценции макрофагов
73 Исследование уровня жизнеспособности УФ- и цитокинмоди-фицированных макрофагов с помощью красителя трипанового голубого
74 Влияние сочетанного действия УФ-света и ФНОа на фагоцитарную активность макрофагов
75 Влияние сочетанного действия УФ-света и фактора некроза опухоли на состояние CR1-рецепторов с лигандированным С4 на поверхности макрофагов
76 Изучение сочетанного действия УФ-света и ФНОа на супероксид-дисмутазную активность макрофагов
77 О процессах, ответственных за изменение функциональной активности фото-и цитокинмодифицированных ма1фофагов
Введение:
Актуальность проблемы. Функционирование иммунной системы контролируется сложной сетью взаимосвязанных информационных сигналов, опосредуемых факторами неспецифического гуморального звена иммунитета. Их продукция и направленное действие на конкретные клетки-мишени определяются сложными молекулярно-клеточными механизмами. Примером тому может служить система комплемента, играющая важную роль в нормальной и патологической физиологии человека. Белки комплемента обеспечивают опсонизацию и лизис чужеродных клеток, участвуя таким образом в формировании иммунного ответа. Связывание активных субфрагментов комплемента со специфическими клеточными рецепторами приводит к локальной модуляции физиологических процессов, координации функциональ^ ной активности и кооперации иммуноцитов, что направлено на поддержание местного гомеостаза. В то же время, клеточные рецепторы комплемента, например CR1-рецептор, являются естественными регуляторами активности самого комплемента.Помимо системы комплемента в процессах иммз^орегуляции задействованы и другие факторы гуморального звена иммунитета, в частности, цитокины, обеспечивающие согласованное функционирование различных типов иммунокомпетентных клеток в процессе индукции развития иммунных . реакций. Цитокины се1д:№тирз^ ются многими клетками и представляют собой единую систему регуляции иммунных процессов, процессов воспаления, а также роста, дифференцировки и функциональной активности клеток различной тканевой принадлежности.Большинство цитокинов обладает плейотропным действием, сопровождающимся модуляцией различных фзшкций, что позволяет рассматривать их как общую систему гомеостатической регуляции клеточной фзшкции, часть сложнейшей цепи взаимосвязанных сигналов, обеспечивающих слаженную работу различных систем в живом оргашаме. Наряду с выполнени^ ем специфических ф^шкций внутри иммунной системы цитокины формируют сеть коммуникационных сигналов и осуществляют межсистемные связи [67, 88]. Такой многофакторный контроль функций иммунной системы организма, осувд^П'вляемый цитокннами, необходим для повышения надежности и обеспечения вариабельности реакций организма в зависимосга от характера агента, вызывающего эти реакции.В современной медицине для лечения ряда заболеваний используются рекомбинантные цитокины, в частности фактор некроза опухоли а [35, 41, 42, 140]. Его мопщое биологическое влияние на иммуногенез, воспалительные процессы и опухолевые клетки позволяет считать фактор некроза опухоли (ФНОа) многообещающим средством иммуногерапии онкологических, воспалительных, инфекционных и аутоиммунных заболеваний, а также при иммунодефицитах, трансплантации органов и тканей [134].Несмотря на широкие перспективы использования ФНО в клинике, необходимо решить ряд проблем, связанных с подбором терапевтических концентраций, трудностью прогнозирования и контроля реакции организма на цитокиновую терапию.Нарушения продукции цитокинов щюдуцирующими клетками, а также процессов взаимодействия гуморальных факторов со специфическими рецепторами иммуноцитов могут лежать в основе формирования патологии на молекулярно-клеточном уровне. В связи с этим изучение межклеточных и клеточно-гуморальных взаимодействий, опосредуемых различными эффекторными моле1оглами, может внести существенный вклад в понимание патогенеза и привести к поиску новых способов регуляции и повышения эффективности функционирования отдельных звеньев иммунной системы.Одним из возможных регуляторов процессов взаимодействия между клеточными и гуморальными факторами иммунитета является УФ-свет. Рядом авторов показано, что клеточные и гуморальные компоненты крови, подвергнутые УФ-облучению в физиологических дозах, могут оказывать регулирующее действие на иммунную систему организма в целом. Известно, что УФ-свет индуцирует быстрые структурно-функциональные изменения поверхностных структур иммунокомпетентных клеток [21, 23, 43, 113, 247, 264], белков системы комшюмента |2,3,30-32], уровня цитокинов [121,229].Йесмотря на большое количество жсп^иментаяьных данных, молекулярные механизмы регуляторного действия УФ-света на клеточные и гуморальные компоненты иммунной системы раскрыты недостаточно. Практичец \ | ски не учитывается роль конформационных изменений макромолекул в определении степени фотомодификации сывороточных факторов, в частности отдельных белков системы комплемента. Кроме того, в литературе практически отсутствуют работы, посвященные аналцзу взаимосвязи структурнофункциональных фотомодификаций иммунокомпетентных клеток крови с процессами их взаимодействия с различными факторами гуморального иммунитета, такими как белки системы комплемента и цитокины. Знания об общих закономерностях и механизмах действия УФ-излучения на клеточные и гуморальные звенья иммунной системы позволят разработать научнообоснованный теоретический фундамент практического использования УФсвета в медицине.Представляется интересным также изучение возможности регулирования иммунологических процессов сочетанным действием на компоненты иммунной системы естественных модуляторов физической и химической природы (к примеру, УФ-света и фактора некроза опухоли). В частности, используя различные концентрации ФНСкх, являющегося медиатором острой фазы воспаления, можно решить ряд проблем, связанных с повышением эффективности применения метода АУФОК 1фи лечении воспалительных процессов различной степени тяжести.Изучение механизмов, лежащих в основе регуляторного действия УФсвета и ФНОа на иммунокомпетентные клетки, позволит выявить причины возникновения патогенеза и возможность их применения с целью иммунокоррекции и иммунотерапии.Цель и задачи диссертационной работы. Целью настоящей работы явилось изучение регуляторного действия УФ-света на стрз^ктурнофункциональное состояние иммзшоцитов (лимфоцитов, макрофагов, нейтрофилов) при их взаимодействии с гуморальными факторами иммунной системы.В связи с этим пере^ нами стояли сяе,^^щве задачи: 1. Изучить влияние УФ-света (240*390 нм, 75,5-^2265 Дж/м^) на процесс взаимодействия мембран иммуноцитов (лимфоцитов, мaiqEюфaгoв, нейтрофилов) с С4 фактором системы комплемента; щ 2. Исследовать структ)фно-фушащональные фотомодификации С4 компонента комплемента; 3. Изучить ФНО-продущфующую способность Т-лимфоцитов и цитотоксическую активность макрофагов в условиях УФ-облучения; 4. Оценить вклад процессов пероксидного фотоокисления липидов в изменение супероксиддисмутазной и пероксидазной активности фотомодифицированных лимфоцитов; 5. Выявить влияние сочетанного действия УФ-света и фактора некроза опухоли а на функциональную активность макрофагов.Научная новизна. Работа является комплексным исследованием, посвященным изучению регуляторного действия УФ-света на функциональную активность иммуноцитов по отношению к С4 фактору системы комплемента и ФНОа.Впервые изучено влияние УФ-света на взаимодействие мембран иммуноцитов (лимфоцитов, макрофагов, нейтрофилов) с С4 фактором системы комплемента и выявлены основные закономерности, обусловливающие данный процесс. Показано, что структурно-функциональные фотомодификации мембран иммуноцитов обусловлены «кэшганг»-эффектом рецепторов с лигандированным С4 фактором комплемента. Разработана схема УФиндуцированных структурно-функциональных изменений С4 компонента комплемента.Выявлено иммунокоррегирующие действие УФ-света на уровень продукции фактора некроза опухоли а Т-лимфоцитами, конечный эффект которого определяется исходной концентрацией цитокина и дозой УФ-света. Обнаружена взаимосвязь ФНО-продуцирующей способности лимфоцитов и цитотоксической активности макрофагов с уровнем генерации активных форм кислорода. Исследовано влияние процессов перокс1здного фотоокисления лшшдов на уровень каталитической активности связанной с мембранами лимфоцитов п^юксидазы.Установлено, что УФ-свет и фактор не1фоза опухоли а оказывают регуляторное действие на фагоцит^ную активность макрофагов. Обсуждается вклад различных процессов (пероксидного фотоокисления липидов, активноч 1^ era НАДФН-юксидазы и супероксиддисмутазы, состояния CR1 клеточного (юцептора) в изменение функционального потенциала 4юто- и ФНО модифицированных махфофагов.Практическая значимость. Научные положения диссертационной работы расширяют и углубляют современные представления о молекулярноклеточном механизме регуляторного действия УФ-света на отдельные звенья иммунной системы.Фотоиндуцированные изменения структурно-функциональных свойств мембран иммуноцитов и отдельных компонентов комплемента необходимо учитывать при обсуждении вопросов, касающихся выяснения механизмов действия УФ-света на молекулярно-клеточном уровне. Полученные экспериментальные данные позволяют выявить общие закономерности регуляторного действия УФ-света на процесс взаимодействия мембран иммуноцитов (лимфоцитов, макрофагов, нейтрофилов) с С4 фактором комплемента.Эксперименты с использованием фактора некроза опухоли а позволяют разработать новые подходы к иммунокоррвкции патологических состояний организма при проведении фармакотерапии и определить возможность применения метода АУФОК на различных стадиях воспалительного щюцесса с целью повышения эффективности его использования.Предложенная схема регуляторного действия УФ-света и ФНОа на функциональные свойства макрофагов может бигть полезна для понимания молекулярных механизмов иммунокоррегирующего действия метода АУФОК. Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на Всероссийском симпозиуме «Клеточная биология на пороге XXI века» (СПб., 2000); IV Съезде по проблемам радиационной биологии (Москва, 2001); Ш Съезде фотобиологов России (Воронеж, 2001); ХУШ съезде физиодш11чвского общества им. И. И Павж»а (Казань, 2001); УШ междун^юдной итферешт по хинвд и физико-хямии олигомерс» «Ojraгом^)ы-2002» (Черноголовка, 2002); IV международной конф^)енции «Циклы природы и общества» (Ставрополь, 2002); VII Пущинской школеЛ конф^жнции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2003); Ш и IV международном симпозиуме «Механизмы действия сверхмалых доз» (Москва, 2002; СПб., 2003);. Научной сессии сотрудников Воронежского госуниверситета (Воронеж, 2002,2003,2004).Публикации. По теме диссертации ощ^бликовано 4 статьи и 8 тезисов, в том числе 3 статьи в реферируемых изданиях.На защиту выносятся следующие положения: 1. УФ-свет (240-390 нм) в дозах 75,5^2265 Дж/м^ индуцирует снижение антителосвязывающей способности С4 компонента комплемента в системе из взаимодействующих иммуноцитов и белков системы комплемента, обусловленное как структурно-функциональными фотомодификациями клеточных мембран, так и процессами, протекающими в сыворотке крови.2. УФ-индуцированные структурные модификации белка С4 связаны с процессом разворачивания белковой молекулы, сопровождающимся увеличением числа ароматических аминокислот и ионогенных групп на поверхности белковой молекулы.3. УФ-излучение в дозах 75,5-^2265 Дж/м оказывает коррегирующее действие на ФНО-продуцирующую способность Т-лимфоцитов, эффект которого в значительной степени определяется исходной концентрацией цитокина, уровнем генфации активных форм кислорода и дозой УФ-света.4. Интенсификация щюцессов пероксидного окисления липидов на мембранах фотомодифиц^ованных лимфоцитов способствует повышению их супероксиддисмутазнои и пероксидазнои активности, а также снижению каталитической активности связанной с клетками экзогенной пероксидазы.5. УФ-изл5^ение в дозах 75,5-^2265 Дж/м вызывает разнонаправленные эффекты в отношении цитотоксической и фагоцитарной активности макрофагов. Сочетанное действие Уфгсвета и фактора не1фоза опухоли а оказывает модулирующий эффект на фуикцщташьвое сосшзшие ма1фофагов.6. Осема возможных регуляторных процессов, протекающих при сочетанном действии УФ-света и фактора некроза О1огхоли а на функциональную активность макрофагов.Структура и объем диссертшши. Диссешшшонная работа включает 208 страниц машинописного текста, 24 таблицы, 42 рисунка. Состоит из введения, семи глав, заключения, выводов и приложения. Список литературы содержит 287 работ, из них 139 отечественных и 148 зарубежных. h • ^
