Главная » 2014 » Июль » 19 » Скачать Пространственная структура цитотоксинов Naja oxiana и их взаимодействие с мицеллами и биомембранами. Дубинный, Максим Анатольевич бесплатно
4:06 AM
Скачать Пространственная структура цитотоксинов Naja oxiana и их взаимодействие с мицеллами и биомембранами. Дубинный, Максим Анатольевич бесплатно
Пространственная структура цитотоксинов Naja oxiana и их взаимодействие с мицеллами и биомембранами
Диссертация
Автор: Дубинный, Максим Анатольевич
Название: Пространственная структура цитотоксинов Naja oxiana и их взаимодействие с мицеллами и биомембранами
Справка: Дубинный, Максим Анатольевич. Пространственная структура цитотоксинов Naja oxiana и их взаимодействие с мицеллами и биомембранами : диссертация кандидата физико-математических наук : 03.00.02 Москва, 2006 97 c. : 61 07-1/160
Объем: 97 стр.
Информация: Москва, 2006
Содержание:
Введение
Глава I Цитотоксины (кардиотоксины) из яда змей семейства Elapidae (аспидов): структурно-функциональные -jq аспекты (Литературный обзор)
Первичные структуры цитотоксинов
Эволюция цитотоксинов внутри семейства и с другими токсинами
Пространственная структура цитотоксинов
Механизм биологической активности
Лизис клеток
Деполяризация возбудимых клеток
Влияние на активность ферментов
Антибактериальная активность
Синергизм действия с фосфолипазой А2
Клеточные мишени и модели связывания
Взаимодействие с липидами
Белковые и углеводные мишени
Актуальность и перспективы структурно-функциональных исследований цитотоксинов
Глава II Результаты и обсуждение
1Конформационная гетерогенность и пространственная структура цитотоксина ЦТМ из яда кобры N п oxiana в 45 водном растворе
Отнесение сигналов основной и минорной компонент спектров ЯМР
Константы спин-спинового взаимодействия
Вторичная структура
Соотношение и обмен основной и минорной конформаций
Прочно связанные молекулы воды
Данные для расчета и характеристики качества полученных пространственных структур gl
Пространственная структура основной формы
Пространственная структура минорной формы 70 Организация гидрофильных и гидрофобных боковых цепей на поверхности молекулы У
IIКомплекс цитотоксина ЦТИ с мицеллами додецилфосфохолина
ЦТН образует комплекс с мицеллами ДФХ
Влияние гидрофобного аниона (тозилата) на связывание ЦТП с мицеллой ДФХ
Данные для расчета и характеристики качества полученной пространственной структуры ЦТИ в комплексе с мицеллой ДФХ gQ
Пространственная структура цитотоксина ЦТИ в комплексе с мицеллой ДФХ gg
Эффект 5- и 16-доксилстеаратов на сигналы протонов ЦТП, связанного с мицеллой ДФХ g^
Конформационные особенности петли I ЦТП, важные для его связывания с мицеллой ДФХ
Модель комплекса ЦТП/[мицелла ДФХ]
Глава III Материалы и методы
ЦТИ, ДФХ и другие материалы: получение и характеристики
Приготовление ЯМР образцов
Спектроскопия ЯМР
Сбор данных для расчета пространственной структуры
Определение конформации пролиновых колец
Боковые цепи в процедуре вычисления пространственной структуры дд
Прочно связанные молекулы воды: процедура поиска и включения в расчеты пространственной структуры ^ qq
Расчет и анализ пространственной структуры
Построение модели комплекса ЦТП/[мицелла ДФХ]
ВЫВОДЫ
Введение:
Среди огромного числа токсинов природного происхождения одно из центральных мест занимают животные яды, или зоотоксины, - уникальная по химической природе и физиологическому действию группа соединений. Зоотоксины применяютя как инструменты исследования в молекулярной биологии, нейрофизиологии, медицине; с их помощью создаются лекарственные и диагностические средства.
Особый интерес представляют змеиные яды - сложный комплекс биологически активных соединений - ферментов, главным образом гидролаз, токсических полипептидов, ряда белков со специфическими биологическими свойствами (фактор роста нервов, антикомплементарный фактор), а также неорганических компонентов. Содержание токсинов различных групп в ядах змей весьма неравномерно. Так, в яде змей семейства Elapidae, или аспидов, насчитывающем около 180 видов (среди них кобры, бунгарусы, австралийские тигровая змея и тайпан и т. д.), в основном, представлены и имеют наибольшее патогенетическое значение пост- и пресинаптические токсины (нейротоксины) и мембраноактивные полипептиды (МАП).
В связи с трудностями сравнительного анализа функциональных и структурных особенностей различных неэнзиматических токсических полипептидов, прежде всего из-за недостаточной степени их очистки, на первых этапах изучения химического состава ядов различные авторы присваивали разные наименования полипептидам, которые впоследствии оказались близкими, а подчас и идентичными по своей химической структуре и фармакологическим эффектам. Так, МАП исторически получали либо буквенно-цифровое обозначение (токсин у, пик 12В и т. д.), либо название исходя из проявленного патофизиологичексого эффекта (кардиотоксин; цитотоксин; прямой литический фактор; фактор, деполяризующий скелетную мускулатуру) или исходя из присущего им основного характера (кобрамин). Позднее было установлено близкое сходство в химической структуре этих полипептидов. Были получены доказательства, что гемолитическая, цитотоксическая, кардиотоксическая и другие виды активности присущи большинству этих токсинов. Поэтому в 70-е годы группу основных полипептидов из ядов семейства Elapidae, не обладающих специфической нейротоксической активностью, но эффективно воздействующих на биологические мембраны, было предложено называть мембраноактивными полипептидами - МАП. Однако, этот термин не прижился, и эти полипептиды называют - цитотоксинами - как правило, в русскоязычной литературе, и -кардиотоксинами - в зарубежной.
Среди токсических полипетидов яда аспидовых змей наиболее полно изучены нейротоксины постсинаптического действия. "Короткие" представители нейротоксинов постсинаптического действия и цитотоксины - белки с небольшой молекулярной массой (6.5 - 7.0 кДа) имеют по четыре дисульфидных мостика в идентичных позициях их аминокислотных последовательностей. "Короткие" нейротоксины и цитотоксины имеют большую гомологию и являются (3-структурными белками. Несмотря на эти общие черты они демонстрируют различную биологическую активность. Нейротоксины блокируют нервную передачу, избирательно связываясь с никотиновым ацетилхолиновым рецептором. В отличие от нейротоксинов, цитотоксины показывают целый перечень биологических активностей, таких как:
Ш лизис различных типов клеток, таких как эритроциты, клетки эпителия, эмбриональные клетки легких и определенных типов опухолевых клеток;
Ш деполяризация мышечных клеток гладкой, поперечно-полосатой и сердечной мускулатуры, вызывающая мышечные сокращения;
Ш влияние на активность ферментов, например, таких как протеинкиназа С, Na^-K АТФ-аза, фосфатидилинозитная киназа;
Ш антимикробная активность - против некоторых грам-положительных бактерий. Для различных цитотоксинов характерна также разная степень проявления той или иной активности.
Вместе с тем, для цитотоксинов до сих пор нет полной ясности в определении мишен(и)/(ей) и механизма действия. С недавнего времени ведутся интенсивные исследования структурных основ всего многообразия биологических свойств, демонстрируемых цитотоксинами.
Для понимания молекулярного механизма действия цитотоксинов необходимы, прежде всего, пространственные структуры высокой точности, установленные в различных средах.
Основные виды биологической активности цитотоксинов связаны с их способностью взаимодействовать с клеточной мембраной. Некоторые липидные, белковые, углеводные и другие компоненты биологических мембран рассматриваются как потенциальные мишени цитотоксинов. Связывание с фосфолигшдами, составляющими основу биологических мембран, несомненно, важное звено в механизме действия этих полипептидов. На сегодняшний день установление пространственной структуры цитотоксинов, связанных с фосфолипидным бислоем, невозможно, поэтому особый интерес представляют структурные исследования этих токсинов в системе, моделирующей липидное мембранное окружение - мицеллах детергента.
В Институте биоорганической химии им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН ранее была определена первичная структура и проведены исследования взаимодействия с модельными мембранами цитотоксина II из яда кобры Naja naja oxiana (ЦТП). Данная диссертационная работа, выполненная в лаборатории ядерного магнитного резонанса (ЯМР) Института, является продолжением структурно-функциональных исследований ЦТП.
Современное развитие метода ЯМР позволяет получать необходимые данные для установления высокоточных пространственных структур, подвижности и стехиометрии макромолекул в водном растворе и некоторых других средах. Детергент додецилфосфохолин (ДФХ) образует мицеллы, которые в отличие от мембран пригодны и традиционно используются для ЯМР исследований структурных и других основ взаимодействия с липидами мембранных и мембраносвязывающих белков. Это позволило использовать ДФХ в качестве среды, имитирующей биологическую мембрану, для исследования пространственной структуры ЦТП.
Задачами данной работы являлось: определение пространственных структур ЦТП в водном растворе и мицеллах ДФХ; установление участков ЦТП, участвующих во взаимодействии с мицеллой ДФХ, и выявление их структурных особенностей; получение модели комплекса ЦТП/[мицелла ДФХ]. В процессе работы было разработано несколько новых методик и подходов, которые могут использоваться в расчетах пространственных структур и моделей связывания с мицеллами других белков.
В Главе I, являющейся Литературным обзором, обсуждаются современные представления о цитотоксинах (кардиотоксинах), с точки зрения структуры, функции и их взаимосвязи. В основной части работы, изложенной в Главе II и состоящей из двух разделов, представлено структурно-функциональное исследование ЦТП в водном растворе и среде, моделирующей фосфолипидное мембранное окружение. Первый Раздел Главы II посвящен установлению конформационной гетерогенности ЦТП и определению пространственной структуры двух форм ЦТП в водном растворе. Второй Раздел посвящен установлению пространственной структуры и построению модели связывания ЦТП в комплексе с мицеллой ДФХ. В Главе III, Материалы и Методы, приведены сведения об использованных в диссертационной работе веществах, образцах для экспериментов ЯМР, экспериментальных, расчетных, теоретических методах определения и анализа пространственной структуры и параметров связывания с мицеллой, стратегии получения модели связывания ЦТП в комплексе с мицеллой. Основные результаты работы суммированы в Выводах. В Приложении приведены некоторые дополнительные сведения и список использованных сокращений.
