Главная » 2014 » Июль » 22 » Скачать Продукция метаболитов кофейной кислоты в обычных и трансформированных геном rolC культурах клеток Eritrichium sericeum (Lehm. бесплатно
9:11 PM
Скачать Продукция метаболитов кофейной кислоты в обычных и трансформированных геном rolC культурах клеток Eritrichium sericeum (Lehm. бесплатно
Продукция метаболитов кофейной кислоты в обычных и трансформированных геном rolC культурах клеток Eritrichium sericeum (Lehm. DC.)
Диссертация
Автор: Инюшкина, Юлия Витальевна
Название: Продукция метаболитов кофейной кислоты в обычных и трансформированных геном rolC культурах клеток Eritrichium sericeum (Lehm. DC.)
Справка: Инюшкина, Юлия Витальевна. Продукция метаболитов кофейной кислоты в обычных и трансформированных геном rolC культурах клеток Eritrichium sericeum (Lehm. DC.) : диссертация кандидата биологических наук : 03.00.23 / Инюшкина Юлия Витальевна; [Место защиты: Биолого-почвен. ин-т ДВО РАН] Владивосток, 2008 98 c. : 61 09-3/303
Объем: 98 стр.
Информация: Владивосток, 2008
Содержание:
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
11 Ботаническая характеристика семейства Boraginaceae (бурачниковые) • i
12 Фитохимическая характеристика семейства Boraginaceae
13 Фармакологические свойства метаболитов кофейной кислоты
14 Биосинтез розмариновой кислоты и ее производных
15 Цитохром Р450-зависимые монооксигеназы растений
16 Влияние гена rolC на трансформированные клетки растений
17 Влияние элиситоров на продукцию вторичных метаболитов в клетках растений
2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
21 Объект исследования
22 Бактерии и плазмиды
23 Культивирование бактериальных штаммов
24 Питательные среды
25 Получение клеточных культур Е sericeum
251 Получение контрольных и ro/C-трансгенных культур Е sericeum
252 Получение культуры трансгенных корней Е sericeum
253 Получение клеточной линии Е-
254 Динамика роста каллусных культур Е sericeum и накопления ими полифенолов
26 Эксперименты с активаторами биосинтеза полифенолов
27 Выделение плазмидной ДНК
28 Доказательство трансгенности и экспрессия генов
281 Выделение растительной ДНК
282 Полимеразная цепная реакция на препаратах ДНК
283 Выделение тотальной растительной РНК
284 Реакция обратной транскрипции
285 Полимеразная цепная реакция на препаратах кДНК
286 Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени (Real-time PCR)
29 Секвенирование ДНК и кДНК
210 Определение содержания полифенолов в культурах клеток Е sericeum
211 Исследование фармакологической активности метаболитов кофейной кислоты из каллусной культуры Е sericeum
2111 Влияние препаратов из клеточной культуры Е sericeum на функцию почек у крыс
2112 Влияние препаратов из клеточной культуры Е sericeum на течение экспериментального острого воспаления
2113 Влияние препаратов из клеточной культуры Е sericeum на процессы свободно-радикального окисления
212 Статистическая обработка результатов
3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
31 Характеристика клеточных культур Е sericeum
311 Клеточные культуры Е sericeum
312 Доказательство трансгенности культур Е sericeum
313 Доказательство экспрессии гена rolC в го/С-трансгенных культурах Е sericeum
32 Накопление полифенолов в культуре клеток Е sericeum \ 321 Содержание метаболитов кофейной кислоты в культурах корней и каллусов Е sericeum
322 Получение высокопродуктивной каллусной культуры Е sericeum методом селекции
323 Влияние метилжасмоната и глицерата меди на продукцию метаболитов кофейной кислоты в культуре клеток Е sericeum
33 Изменение содержания метаболитов кофейной кислоты при длительном культивировании каллусов
34 Дифференциальная активация транскрипции специфических изоформ генов вторичного метаболизма под действием гена rolC
341 Экспрессия генов PAL
342 Экспрессия генов CYP
35 Фармакологические свойства препарата из клеточной культуры Е sericeum и возможность ее применения в медицине
351 Стабильность рабдозина и розмариновой кислоты в процессе сушки каллусов
352 Влияние препарата из клеточной культуры Е sericeum на функцию почек у крыс
353 Влияние метаболитов кофейной кислоты из клеточной культуры Е sericeum на течение экспериментального острого воспаления
354 Влияние препарата из клеточной культуры Е sericeum на процессы свободно-радикального окисления
Введение:
Одним из перспективных направлений биотехнологии растительной клетки является получение вторичных метаболитов для фармацевтической промышленности.Это подход получает распространение в нашей стране и мире, поскольку создает воспроизводимый источник сырья для получения биологически активных веществ.Биотехнологическое получение вторичных метаболитов основано на том, что клеточные культуры растений сохраняют свойство целого растения синтезировать и накапливать эти вещества. Клетки растений можно выращивать неопределенно долго (каллусы женьшеня растут в культуре in vitro уже более 50 лет), состав сред для них относительно прост, путем различных манипуляций часто удается повысить содержание вторичных метаболитов. Кроме того, система растительной клетки in vitro - это удобная модель для изучения вторичного метаболизма клетки, поскольку исследователь может управлять ее функционированием через изменение условий культивирования или экспрессии генов.В настоящее время растет спрос на лекарственные препараты природного происхождения (Dixon and Sumner, 2003). Экстракты лекарственных растений широко применяют в медицине, парфюмерии и пищевой промышленности (Ullah and Khan., 2008). Активно изучаются антиоксидантные и противовоспалительные свойства растительных полифенолов, в том числе метаболитов кофейной кислоты (Ivanauskas et al., 2008; Ueda et al., 2002). Известно, что полифенолы растений перспективны для профилактики и лечения заболеваний почек, связанных с нефритом. Так, при лечении диабетической нефропатии применяются метаболиты кофейной кислоты: розмариновая кислота и литоспермовая кислота Б (Makino et al., 2002), содержащиеся в растениях семейства Boraginaceae.На Дальнем Востоке это семейство представлено несколькими видами, в том числе незабуд очником шелковистым {Eritrichium sericeum Lehm. DC.) и воробейником краснокорневым (Lithospermum erythrorhizon Sieb. et Zucc). Эти виды растений являются редкими и их промышленное использование невозможно.Поэтому разработка новых лекарственных средств на основе клеточных культур этих растений является перспективной задачей для биотехнологии.Современная биотехнология растений широко использует методы генетической инженерии. Так, например, в последние годы выявлены гены, оказывающие существенное влияние на продукцию вторичных метаболитов в культурах клеток растений, в том числе гены rol Agrobacterhim rhizogenes. В большинстве случаев эти гены активируют биосинтетическую способность культур, однако также известны случаи ингибирования (Bulgakov, 2008). К сожалению, информация о механизме действия продуктов этих генов на вторичный метаболизм очень ограничена. Влияние генов rol на биосинтез вторичных метаболитов фенилпропаноидного пути ранее не исследовалось. В настоящей работе приведена сравнительная характеристика продукции метаболитов кофейной кислоты в обычной и ro/C-трансгенной культурах клеток Е. sericeum.Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось изучение биосинтеза метаболитов кофейной кислоты в культурах клеток незабудочника шелковистого и получение продуктивной клеточной линии.Для достижения поставленной цели решались следующие задачи: 1. Получить контрольную и экспрессирующую ген rolC культуры клеток Е. sericeum.2. Увеличить выход метаболитов кофейной кислоты в культуре клеток Е. sericeum посредством селекции и воздействия элиситоров.3. Исследовать связь между экспрессией гена rolC и экспрессией некоторых ключевых генов биосинтеза метаболитов кофейной кислоты.4. Исследовать фармакологическое действие полифенолов из культуры клеток Е. sericeum.Основные положения, выносимые на защиту.1. Высокопродуктивная культура клеток Е. sericeum (линия Е-4) накапливает метаболиты кофейной кислоты в количестве до 6% от сухой массы ткани.2. Экспрессия гена rolC в клетках Е. sericeum приводит к активации биосинтеза метаболитов кофейной кислоты в длительно-пассируемых культурах и увеличению продуктивности культуры.3. Ген rolC вызывает активацию экспрессии специфической формы гена CYP98 (CYP98A3), ответственной за биосинтез розмариновой кислоты.4. Полифенолы культуры клеток Е. sericeum обладают выраженным антиоксидантным и противовоспалительным действием.Научная новизна. Показано, что клеточные культуры незабудочника шелковистого синтезируют метаболиты кофейной кислоты в больших количествах, многократно превышающих содержание этих веществ в природных растениях.Установлена зависимость действия гена rolC на продукцию метаболитов кофейной кислоты от времени культивирования каллусов - с возрастанием числа пассажей ген проявляет активирующее действие на вторичный метаболизм. В культурах клеток незабудочника шелковистого обнаружен ген CYP98A3, кодирующий специфическую форму цитохром Р450-зависимой монооксигеназы, вовлеченную в биосинтез розмариновой кислоты. Установлена взаимосвязь экспрессии CYP98A3 с экспрессией гена rolC и повышением содержания метаболитов кофейной кислоты в rolC-трансгенной культуре клеток.Практическая значимость. Получена клеточная культура незабудочника шелковистого, которая является воспроизводимым источником метаболитов кофейной кислоты. Максимальное содержание рабдозина в ней составляет 4.11% от сухого веса ткани, что является самым высоким содержанием этого вещества в природных и биотехнологических источниках. Показано, что полифенолы из культуры клеток незабудочника шелковистого обладают выраженным антиоксидантным действием, снижают симптомы при остром воспалении, что делает их перспективными для углубленного фармакологического изучения с целью создания в дальнейшем медицинских препаратов.Апробация работы. Результаты исследований были представлены на конференции молодых ученых Биолого-почвенного института ДВО РАН (2006), II Международном конгрессе по молекулярному размножению растений (2nd International Conference on Plant Molecular Breeding) (КНР, Санья, 2007), 21-м Тихоокеанском научном конгрессе (21st Pacific Science Congress) (Япония, Окинава, 2007), Международной конференции по биоинформатике (International Multi-conference of Engineers and Computer Scientists) (Гонконг, 2008), 13-м Международном симпозиуме по биотехнологии "13th International Biotechnology Symposium (IBS-2008)" (КНР, Далянь, 2008).Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 работ, из них 3 статьи в рецензируемых журналах из списка ВАК. Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 3 глав, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 98 страницах, иллюстрирована 19 рисунками и содержит 12 таблиц. Список литературы содержит 90 наименований.Работа выполнена в группе биоинженерии Биолого-почвенного института ДВО РАН. Химический анализ полифенолов Е. sericeum проводился совместно с сотрудниками лаборатории химии природных хиноидных соединений Тихоокеанского института биоорганической химии ДВО РАН. Фармакологические исследования биомассы клеток Е. sericeum выполнялись совместно с сотрудниками Алтайского государственного медицинского университета (Барнаул).Работа выполнена при финансовой поддержке грантов ФЦНТП "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники" (2002-2006 гг), "Научные школы" НШ-6923.2006.4., Президиума РАН "Молекулярная и клеточная биология" и РФФИ/ДВО 06-04- 96008 .Благодарности. Автор выражает глубокую признательность своему научному руководителю В.П. Булгакову за внимательное и конструктивное руководство, благодарность сотрудникам группы биоинженерии К.В. Киселеву за помощь в освоении методик молекулярной биологии и руководство при выполнении генетической части настоящей работы, Г.К. Чернодед за помощь в работе с культурами клеток, Ю.Н. Шкрыль за методическую помощь. Автор выражает благодарность сотрудникам ТИБОХ ДВО РАН А. Федорееву и М.В. Веселовой за сотрудничество и помощь в определении качественного и количественного состава полифенолов культур клеток и корней Е. sericeum^ а так же коллегам из Алтайского государственного медицинского университета под руководством проф. Зверева Я.Ф за выполнение фармакологических исследований.
