Главная » 2014 » Июнь » 27 » Скачать Оптимизация процесса производства отечественного генно-инженерного инсулина человека. Купцов, Василий Николаевич бесплатно
4:30 AM
Скачать Оптимизация процесса производства отечественного генно-инженерного инсулина человека. Купцов, Василий Николаевич бесплатно
Оптимизация процесса производства отечественного генно-инженерного инсулина человека
Диссертация
Автор: Купцов, Василий Николаевич
Название: Оптимизация процесса производства отечественного генно-инженерного инсулина человека
Справка: Купцов, Василий Николаевич. Оптимизация процесса производства отечественного генно-инженерного инсулина человека : диссертация кандидата биологических наук : 03.00.23 Москва, 2007 137 c. : 61 07-3/1184
Объем: 137 стр.
Информация: Москва, 2007
Содержание:
ВВЕДЕНИЕ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Глава
I Сахарный диабет
11 Классификация
12 Клиника
13 Лечение сахарного диабета
14 Показания к ирименению инсулина человека
Глава
II Открытие инсулина и его свойств
21 История от1фытия инсулина
22 Структура инсулина
23 Биосинтез и секреция иисулииа
24 Лиомальные инсулины человека
25 Применение мутантных ГИИЧ в лечебных целях
Глава
III Получение инсулина
31 Химический синтез иисулииа человека
32 Получение полусинтетического инсулина
33 Синтетико-фермеитативный метод получения инсулнна человека
34 Получение генно-инженерного инсулииа человека
341 Использование эукариотов при производстве ГИИЧ
342 Получение ГИИЧ при использовании рекомбинантных штаммов Б соИ
343 Ферменты, используемые при производстве ГР1ИЧ
3431 Трипсин
3432 Карбоксипептвдаза В
344 Производство ГИИЧ в СССР и России
345 Современное производство ГИИЧ в России СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Глава
IV Материалы и методы
41 Материалы
42 Исходиый материал
43 Оборудование
44 Аиализ экспериментальиых материалов РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Глава
V Разработка 1фитериев оценки пригодности фермеитов, исиользуемых в производстве ГИИЧ при трансформации ГБ
51 Фермеиты, применяемые при производстве ГИИЧ
52 Схема тестирования образцов трипсииа
53 Отбор препаратов трипсииа, удовлетворяющих требованиям производства гениоинжеиерного инсулина человека
54 Схема проверки новых партий карбоксипептидазы В
Глава
VI Оптимизация процесса трансформации ГБ при получении иисулина
61 Постадийный гидролиз ГБ с выделением промежуточиых продуктов трипсинолиза
62 Постадийиый гндролиз ГБ трипсином и карбоксипептидазой В без выделения промежуточных продуктов трипсинолнза
63 Одностадийный гидролиз ГБ трипсином и карбоксипептидазой В
631 Подбор оптимальной температуры для одностадийного гидролиза ГБ
632 Подбор оптимального рН для одностадийного гидролиза ГБ
633 Подбор оптимальных условий подготовки фермеитов для одностадийного гидролиза ГБ
634 Подбор оптимальных концентраций ферментов для одностадийного гидролиза ГБ
Глава
VII Оптимизация условий хроматографической очистки диаргинининсулина 1 Подбор оптимальной концентрации мочевины в буферных растворах
72 Подбор оптимальной концентрации буферной соли в буферных растворах
73 Масштабирование экспериментальных результатов на нромышленный процесс
Глава
VIII Использование результатов экспериментов в производстве ГИИЧ
81 Проведение препаративного совместного гидролиза ГБ при получении ГИИЧ
82 Проведение хроматографической очистки ГИИЧ на SP-Sepharose FF
Глава IX Получение ГИИЧ при использовании нового ГБ
91 Проведение триптического гидролиза HINS
92 Разработка условий хроматографической очистки диаргинининсулина из трипсинолизата HINS
93 Разработка условий проведения совместного гидролиза HINS
94 Проведение экспериментальной хроматографии инсулина, полученного в результате совместного гидролиза HINS11 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Введение:
Актуальность. Инсулин гормон белковой природы, вырабатываемый Р-клетками поджелудочной железы для поддержания гомеостаза глюкозы в крови [1,2]. Недостаток инсулина в крови вследствие приобретенных или наследуемых факторов приводит к заболеванию сахарным диабетом (СД) [2, 3, 4]. Это системное заболевание, следствием которого является высокое содержаиие глюкозы в крови, вызывает поражение многих внутренних органов и систем организма, что неизбежно ведет к ухудшению качества жизни, а без лечения к смерти. СД называют «болезнью цнвилизации», т.к. первые его описания относятся к античным временам. Инсулии относится к жизненно важным лекарственным средствам, которые Всемирная организация Здравоохранения рекомендует самостоятельно производить тем странам, чье население превьппает 50 млн. человек [5]. Впервые инсулин был выделен в чистом виде и применен для лечения в 1921 г., а уже в 1923 г. начато его массовое производство. В то время едииственным доступным для промышленного использования источииком инсулина являлись поджелудочные железы крупного рогатого скота и свиней, поступавшие с боен [1,6]. Этому способствовало отсутствие видовой специфичности в проявлении функций у инсулинов различного происхождения. Однако, по мере накопления данных о последствиях инсулннотерапии выяснилось, что у большого количества пациентов по мере применения животного инсулина развивается ряд серьезных осложнений: падает чувствительность к вводимому инсулину, что приводит к постоянной корректировке вводимой дозы; проявляются различиые аллергические реакции, накапливаются антитела к инсулину и т.д. Данные проблемы связывали с развитием иммунной реакции, которая вызвана структурными отличиями инсулина человека от животных инсулинов [6]. Только в конце 50-х, начале 60-х годов XX века развитие молекулярной биологии позволило определить структуру инсулинов различного происхождения. Результаты данных исследований легли в основу разработок промышленного получения инсулина, идеитичного человеческому, основными способами получения которого, в настоящее время, являются полусинтетический и биотехнологический. При нспользованни полусннтетического метода свиной инсулин подвергается хнмнческой модификации [1, 6]. Биотехнологическим путем инсулин производят используя высокопродуктивные генетически измененные микроорганизмы. Полусннтетический метод полностью зависит от сырья, поступающего с боен. Биотехнологический метод лишен этого недостатка, так как потребляет только энергоресурсы[7]. Также важным достоинством биотехнологического метода является простота масштабирования процесса. Поэтому, полученне инсулнна при помощи высокопродуктивных штаммов рекомбинантных микроорганизмов, обеспечивающих стабильный уровень экспрессии встроенного гена инсулина человека, становнтся актуальным. Однако в микроорганизмах инсулин синтезируется в виде неактивного биотехнологического предшественника, гибридного белка (ГБ), поэтому получение генно-инженерного инсулина человека (ГИИЧ) является сложным многостадийным процессом, основанным на нескольких этапах трансформации и препаративной очистке промежуточных продуктов и инсулина. Это отражается на выходе и стоимости генно-инженерного инсулииа. В связи с этим значительно возрастает значение разработки оптимальной технологической схемы, обеспечивающей высокий выход, и чистоту конечного продукта. Основными направлениями по оптимизации технологии производства являются поиск легко вписываемых в существующую технологию, дающих заметный выигрыш по времени, уменьшающих себестоимость н легко масштабируемых решений на основе существующего оборудования. Настоящая работа основана на исследованиях, проведенных по оптимизации стадии получения первичного инсулина (инсулина, имеющего чистоту 90-96% и являющегося сырьем для стадий финишной очистки инсулина методами высокоэффективной жидкостной, гидрофобной, гель-эксклюзивной хроматографии и др.) из ГБ. Работа проводилась в Федеральном государственном унитарном предприятии «22 Центральный научно-исследовательский испытательный ннстнтут Минобороны России». Результаты диссертации проверяли на базе существующего производства генно-ннженерного инсулина человека в ОАО «Национальные биотехнологии». Проектирование данного пронзводства было начато в 1996г. на основе совместных разработок коллективов ГНЦ ПМ (п. Оболенск) и ИБХ РАН им. М.М. Шемякииа и Ю.А. Овчинникова. В 2003г. в п. Оболеиск была запущена производственная линия, основанная на получении ПШЧ из гибридного белка, продуцентом которого являлся щтамм E.coliJM109/pPINS07. Пелью исследования стало усовершенствование технолопш получения генноинженерного инсулина человека с целью сннжения себестоимости и увеличения выхода конечного продукта. Перед началом работы основными проблемами производства были: использоваиие дорогих ферментов иностранного пронзводства из-за отсутствия ме- тодик поиска более дещевых отечественных аналогов; примененне буферных растворов с высоким содержанием мочевины при хромато- графической очистке диаргинннннсулина (ДАИ) на промежуточной стадии получения ГИИЧ; примененне технологической схемы трансформации ГБ в инсулин с большим коли- чеством промежуточных стадий (т.н. схема
