Главная » 2014 » Август » 21 » Скачать Морфологический и молекулярный анализ ангиогенеза при моделировании ишемии и реваскуляризации миокарда. Сергеевичев, Давид бесплатно
7:35 AM
Скачать Морфологический и молекулярный анализ ангиогенеза при моделировании ишемии и реваскуляризации миокарда. Сергеевичев, Давид бесплатно
Морфологический и молекулярный анализ ангиогенеза при моделировании ишемии и реваскуляризации миокарда
Диссертация
Автор: Сергеевичев, Давид Сергеевич
Название: Морфологический и молекулярный анализ ангиогенеза при моделировании ишемии и реваскуляризации миокарда
Справка: Сергеевичев, Давид Сергеевич. Морфологический и молекулярный анализ ангиогенеза при моделировании ишемии и реваскуляризации миокарда : диссертация кандидата биологических наук : 03.00.25 / Сергеевичев Давид Сергеевич; [Место защиты: Науч.-исслед. ин-т регион. патологии и патоморфологии СО РАМН] - Новосибирск, 2009 - Количество страниц: 102 с. ил. Новосибирск, 2009 102 c. :
Объем: 102 стр.
Информация: Новосибирск, 2009
Содержание:
ОГЛАВЛЕНИЕ
Список сокращений
ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
11 Костный мозг как источник клеток-предшественников неоваскулогенеза
12 Особенности эмбриогенеза сосудистой системы
121 Эндотелиальные клетки во время эмбрионального развития
122 Формирование первичного капиллярного сплетения
123 Ремоделирование капиллярного сплетения в артерии и вены
124 Молекулярные маркеры эндотелиальных клеток
13 Формирование сосудов и ангиогенные факторы
131 Модель формирования сосудов
132 Вазо-эндотелиальные факторы роста их разновидности и рецепторы ' ЬЗЗРегуляцияУЕОР
134 Ангиопоэтины и их Tie-рецепторы
135 Angl и стабилизация клеточной стенки
136 Ang2: агонист или антагонист?
14 Лектины
15 Резюме
ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
21 Общая структура эксперимента
22 Характеристика материала
23 Моделирование хронической ишемической болезни сердца
24 Получение мононуклеарной фракции аутологичных клеток костного мозга и разделение ее на фракции
25 Морфологическое исследование образцов
26 Иммуногистохимические и иммуноцитохимические методы исследования
27 Молекулярные методы исследования
28 Проточная цитофлюориметрия
29 Исследование фракций МНК КМ после культивирования в средах направленной клеточной дифференцировки
210 Оценка перфузии миокарда с использованием ^ '^"Tc
211 Статистические методы исследования
ГЛАВА 3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
31 Морфологический анализ миокарда при моделировании хронической ишемической болезни сердца
32 Морфологический анализ миокарда при моделировании хронической ишемической болезни сердца после имплантации прилипающих клеток мононуклеарной фракции костного мозга
33 Морфологический анализ миокарда при моделировании хронической ишемической болезни сердца после имплантации неприлипающих клеток мононуклеарной фракции костного мозга в лазерные каналы
34 Морфометрический анализ миокарда при проведении реваскуляризации
35 Проточный цитофлюориметрический анализ популяций клеток
36 Оценка уровня экспрессии генов-маркеров хондро-остеогенеза
37 Оценка уровня экспрессии генов вазо-эндотелиальных факторов роста в сепарированных мононуклеарных клетках костного мозга
38 Исследование уровня экспрессии мРНК генов VEGF-A и SDF в ишемизированном миокарде и зонах реваскуляризации
39 Иммуноцитологическое исследование клеточных популяций в средах направленной дифференцировки
310 Анализ перфузии миокарда по данным сцинтиграфии после операции комплексной реваскуляризации
ГЛАВА 4 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
ВЫВОДЫ
Введение:
Актуальность темы. Ишемические состояния органов, в том числе инсульты, атеросклероз нижних конечностей, облитерирующий эндартериит, ишемическая болезнь сердца и их осложнения, занимают ведущее место среди причин инвалидизации и смертности преимущественно трудоспособного населения. Несмотря на значительный прогресс в профилактике рисков их развития и лечении, включая широкое распространение хирургических и эн-доваскулярных методов реваскуляризации, медико-социальная значимость этих патологий не снижается. По характеру и выраженности последствий, наносимых обществу (общей утрате трудоспособного населения), эти заболевания занимают второе место после рака легкого, поскольку являются наиболее частой причиной смерти в молодом возрасте. В связи с этим, разработка альтернативных методов улучшения кровоснабжения ишемизированных тканей остается актуальной. Терапевтический ангиогенез, который иногда называют биологическим шунтированием, представляет собой новую тактику улучшения перфузии ишемизированных тканей с помощью усиления естественных, но недостаточных процессов неоваскуляризации. Разработке этой лечебной тактики способствовало развитие современных представлений о молекулярных и клеточных механизмах регуляции роста и ремоделирования кровеносных сосудов.Большое внимание в этом аспекте уделяется теоретическим и практическим разработкам использования клеток мононуклеарной фракции костного мозга (МНФ КМ). Это объясняется их уникальным свойством - пластичностью, т.е. способностью дифференцироваться в клетки практически всех мезенхимальных тканей. Проведен ряд исследований, в которых доказана возможность клеток костного мозга и других источников дифференцироваться в клетки других типов (нейроны головного и спинного мозга, гепатоциты, клеточные популяции поджелудочной железы, в том числе продуцирующие инсулин, эндотелиоциты, миобласты, остеоциты, хондроциты, эпителиоциты и др.), (Деев Р.В. и др., 2005; Волков А.В. и др., 2005; Chen J. et al., 2001; Ar-vidsson A. et al., 2002; Riess P. et al., 2002; Aliotta J.M. et al., 2007).3a время, прошедшее после опубликования первой работы по терапевтическому ангиогенезу (Isner J.M. et al., 1996), было проведено более тысячи исследований, посвященных данной проблеме. Большие надеисды, вызванные многообещающими данными экспериментальных исследований и в основном неконтролируемых клинических исследований, сменились разочарованием после получения результатов масштабных двойных слепых рандомизированных плацебо-контролируемых клинических испытаний, не подтвердивших однозначно эффективность такой тактики (Darwin J. et al., 2007). Более того, в экспериментальном исследовании имплантации несепарированных моно-нуклеарных клеток (МНК) КМ в зоны ишемического поражения миокарда собак выявлен рост костных балок в рубцовой зоне (Ларионов П.М. и др., 2004).После первой публикации (Asahara Т. et al., 1997) об использовании эндотелиальных предшественников многие исследователи сосредоточили свое внимание на применении различных сепарированных клеток МНФ КМ с целью регуляции ангиоваскулогенеза. Появилось множество экспериментальных данных, свидетельствующих об ангиогенной эффективности различных фракций МНК, их сочетаний, генетических модификациях, а также о методах доставки клеток в ишемизированную область. Одним из самых многообещающих методов доставки клеток МНФ в очаг поражения на сегодняшний день является их имплантация в слепые лазерные трансмиокардиальные каналы (Ларионов П.М. и др., 2004; Patel A.N. et al., 2007; Klein H.M. et al., 2004; Angoulvant D. et al., 2004; Zhao H. et al., 2007; Gowdak L.H.W. et al., 2008; Horvath K.A., 2008).Важным этапом в обосновании возможности терапевтического использования МНК с целью коррекции последствий ишемических состояний является изучение молекулярных механизмов активации и ускорения неадекват-ного васкулогенеза, способов оптимизации получения эндотелиальных клеток-предшественников с необходимыми свойствами. Большое значение имеет разработка подходов к снижению побочных эффектов клеточной терапии и комбинированному использованию разных методов реваскуляризации. Это обосновывает актуальность изучения особенностей репаративной регенерации миокарда в условиях хронической ишемии при интрамиокардиальнои имплантации различных клеточных популяций МНФ КМ с использованием в качестве объекта эксперимента животного с относительно большой массой тела.Цель исследования - изучить структурную реорганизацию миокарда и молекулярные механизмы ангиогенеза при моделировании ишемической болезни сердца и трансмиокардиальной лазерной реваскуляризации с использованием интрамиокардиальнои имплантации клеток мононуклеарной фракции костного мозга.Задачи исследования: 1. Изучить морфологические и иммуногистохимические изменения миокарда собак при моделировании ишемической болезни сердца.2.Изучить морфологические и иммуногистохимические изменения миокарда в зонах трансмиокардиальной лазерной реваскуляризации (ТМЛР) с имплантацией МНК КМ.
3.Оценить цитологические и молекулярные особенности прилипающих и неприлипающих к пластику мононуклеарных клеток костного мозга.4.Оценить и сопоставить изменения микроциркуляторного русла в зонах ишемии и реваскуляризации морфологическими и радиологическими методами.5.Изучить цитологические характеристики имплантированных клеток костного мозга, формирующих сосудистую почку.Основные положения, выносимые на защиту.1. Клетки мононуклеарной фракции костного мозга обладают ангиогенным и остеогенным потенциалом.2. Направленная индукция аутологичных хшеток костного мозга в культуре является источником эндотелиальных ьслеток-предшественников.З.К биологическим особенностям прилипающей и неприлипающей фракций мононуклеарных клеток костного мозга относятся минимальные фено-типические и акцентированные молекулярно-генетические различия, что определяет потенциал их использования.Научная новизна.Впервые проведено изучение особенностей структурной реорганизации миокарда собак при моделировании ишемических повреждений и трансмио-кардиальной лазерной реваскуляризации с использованием интрамиокардиальной имплантации клеток МНФ КМ. Установлено, что применение интрамиокардиальной имплантации несепарированпых клеток костного мозга и трансмиокардиальной лазерной реваскуляризации с имплантацией неприлипающей фракции клеток костного мозга в постинфарктный период способствует индукции ангиогенеза в рубцовой и перирубцовой зонах миокарда левого желудочка собак. Выявлены побочные эффекты интрамиокардиальной имплантации несепарированной фракции клеток костного мозга, заключающиеся в появлении очагов эктопической регенерации (оссификации, хондро-генеза).Впервые показано, что кратковременное сепарирование на пластике мононуклеарных клеток костного мозга позволяет получить фракции клеток с различным ангиогенным и остеогенным потенциалом. Показано, что клетки неприлипающей фракции обладают более значительным ангиогенным потенциалом и существенно более низким остео- и хондрогенным потенциалом, чем клетки прилипающей фракции. По данным иммуноцитохимических исследований, около 90% клеток неприлипающей фракции экспрессируют маркеры эндотелиальных клеток - изолектин-В4 и VEGF-R2 (рецептор-2 к вазо-эндотелиальному фактору роста), что позволяет отнести их к эндотели-альным предшественникам. Интрамиокардиальная имплантация неприли-пающих клеток костного мозга способствует усилению экспрессии мРНК VEGF-A (вазо-эндотелиального фактора роста А) и SDF-1 (стромального клеточно-продуцируемого фактора-1), необходимых для интенсификации роста сосудов.Впервые описаны последовательные стадии новообразования сосудов в зонах корригирующих воздействий. Дана цитологическая характеристика ан-гиобластной клетки.Впервые разработан метод комплексного количественного анализа уровня экспрессии мРНК генов семейства VEGF, генов аггрекана, люмикана и остепонтина в клетках различных МНФ КМ собаки.Теоретическая и практическая значимость.Полученные в процессе исследования результаты развивают существующие представления о механизмах направленного ангиоваскулогенеза миокарда в постинфарктный период при использовании лазерных и клеточных технологий.Обоснован метод непрямой реваскуляризации миокарда с использованием импульсного полупроводникового лазера и фракционированных МНК КМ, который используется в клинической практике ФГУ «Новосибирского НИИ патологии кровообращения Росмедтехнологий». Получена приоритетная справка № 2006128967 на выдачу патента на изобретение «Способ лазерного энграфтинга клеток».Апробация работы.Основные положения, выводы и практические рекомендации доложены на VI научных чтениях с международным участием, посвященных памяти академика Е.Н. Мешалкина, «Новые технологии в сердечно-сосудистой хирургии и интервенционной кардиологии» (Новосибирск, 2008). IV Всероссийском съезде трансплантологов памяти академика В.И.Шумакова (Москва, 2008). Всероссийской юбилейной научно-практической конференции патологоанатомов с международным участием к 100-летию проф. П.Г.Подзолкова (Красноярск, 2008), межлабораторной научной конференции ФГУ Новосибирского научно-исследовательского института патологии кровообращения им. акад. Е.Н.Мешалкина Росмедтехнологий и ГУ Научно-исследовательского института региональной патологии и патоморфологии СО РАМН (Новосибирск, 2009).Публикации.По теме диссертации опубликованы 7 работ, в том числе 3 в журналах, рекомендованных ВАК для публикации материалов диссертационных работ.Структура и объем диссертации.Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, главы результатов исследования, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Материал изложен на 102 страницах компьютерного текста, включающего 25 рисунков и 6 таблиц.Список литературы содержит 137 работ. Весь материал, представленный в диссертации, собран, обработан и проанализирован лично автором.
