Главная » 2014 » Август » 27 » Скачать Химические основы спектральных превращений флуоресцентных белков из коралловых полипов. Пахомов, Алексей Александрович бесплатно
5:04 AM
Скачать Химические основы спектральных превращений флуоресцентных белков из коралловых полипов. Пахомов, Алексей Александрович бесплатно
Химические основы спектральных превращений флуоресцентных белков из коралловых полипов
Диссертация
Автор: Пахомов, Алексей Александрович
Название: Химические основы спектральных превращений флуоресцентных белков из коралловых полипов
Справка: Пахомов, Алексей Александрович. Химические основы спектральных превращений флуоресцентных белков из коралловых полипов : диссертация кандидата химических наук : 03.00.04 / Пахомов Алексей Александрович; [Место защиты: Ин-т биоорган. химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН] Москва, 2007 107 c. : 61 07-2/702
Объем: 107 стр.
Информация: Москва, 2007
Содержание:
с п и с о к ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ
1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
11 Пространственная структура GFP-подобных белков
12 Влияние структуры хромофора на спектральные свойства
121 Хромофор GFP-типа
122 "Красный" хромофор DsRed-типа
123 Варианты расширения я-системы GFP-хромофора, сопровождающиесяфрагментацией белка
124 Замена ароматического заместителя в хромофоре GFP
13 Окружение хромофора: тюнинг цвета в GFP-подобных белках
131 Стекинг-взаимодействия с хромофором
132 Ионизация хромофора
133 Конформационное состояние хромофора онределяет безизлучательное(хромо), либо флуоресцентное состояние белка
134 Влияние других аминокислотных остатков в окружении хромофора
2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
21 Реактивы и материалы
211 Реактивы
212 Штаммы
213 Питательные среды для роста бактерий
214 Синтетические олигонуклеотиды
22 Биосинтез и выделение белка
221 Трансформация клеток Я со//плазмидной ДНК
2211 Приготовление компетентных клеток штамма JM
2212 Приготовление компетентных клеток штаммаXL1-Blue
2213 Трансформация плазмидной ДНК
222 Экспрессия генов рекомбинантных белков
223 Выделение рекомбинантных белков
23 Мутагенез
231 Сайт-направленный мутагенез
232 Вьщеление плазмидной ДНК
233 Электрофоретический анализ ДНК в агарозном геле
234 Количественные определения препаратов ДНК
235 Секвенирование ДНК
24 Денатурация и протеолиз белка
241 Денатурация в кислых условиях и протеолиз белка пепсином
242 Денатурация в щелочных условиях и протеолиз белка химотрипсином
25 Выделение хромопептидов
26 УФ-видимая спектрофотометрия и флуорометрия
27 ЭПР-спектрометрия
28 Масс-спектрометрия
29 Компьютерное моделирование пространственной структуры белка
210 Кинетический анализ созревания белка
3, РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
31 Изучение структуры хромофора Z2FP
311 Биосинтез и вьщеление белка z2FP
312 Денатурация и протеолиз белка z2FP
313 Выделение хромонептида
314 Масс-спектрометрические исследования хромопептида
315 Зависимость синтеза хромофора z2FP574 от света
32 Кинетические особенности созревания "красного" хромофора вZ2FP
33 Сравнительный мутагенез белков Z2FP574 и zFP
331 Мутагенез, экспрессия генов мутантных форм белка, их вьщеление и очистка
332 Свойства мутантного белкаzFP506 N66D
3321 Изучение кинетических особенностей образования "красного" хромофораezFP506N66D
3322 Исследование зелено-красного превращения zFP506 N66D при помощимасс-спектроскопии
3323 Изучение механизма конверсии zFP506 N66D с помощью ЭИР
333 Влияние декарбоксилирования на окисление хромофора
3331 Свойства мутантного белка z2FP574 D66A
3332 Свойства мутантного белка z2FP574 D66N
3333 Свойства мутантного белка z2FP574 D66E
34 Инициация Z2FP574 механизма в других белках Влияние окисления надекарбоксилирование хромофора
342 Мутагенез cgCP
35 Механизм декарбоксилирования хромофора Z2FP
36 Перспективы использования процесса сопряженного окисления-декарбоксилирования флуоресцентных белков в биотехнологии 88ВЫВОДЫ
Введение:
Зеленый флуоресцентный белок (GFP) и его гомологи нашли широкоеприменение в современной молекулярной и клеточной биологии благодаряуникальному свойству образовывать хромофор из собственных аминокислот безучастия внешних кофакторов за исключением молекулярного кислорода [1,2, 3, 4, 5,6]. Таким образом, цвет флуоресцентного белка кодируется его геном. Этаособенность находит применение в in vivo мечении клеточных объектов и позволяетиспользовать GFP-подобные белки для решения таких задач, как мечение белков [7],слежение за экспрессией генов [8], исследование транспорта и взаимодействийбелков [9]. Помимо этого, варианты GFP-подобных белков, могут бытьиспользованы как внутриклеточные биосенсоры рН [10], окислительновосстановительного потенциала [11], иопов Са^ ^ [12] и др.К настоящему времени цветовая палитра, образуемая известнымифлуоресцентными белками, перекрывает видимую область спектра от синего додальне-красного [13, 14, 15, 16]. Такое цветовое разнообразие определяется восновном структурой хромофора. В природных GFP-нодобных белках хромофорформируется путем циклизации аминокислот X-Tyr-Gly полинептидной цепи белка,сопровождаюш;ейся дегидратацией и дегидрогенированием [17]. В результатеобразуется хромофор, 4-(и-гидроксибензилиден)-5-имидазолон [18],характеризуюш;ийся флуоресценцией с максимумом эмиссии при -500 нм. Такой"зеленый" хромофор может претерпевать различные модификации, в результатекоторых происходит расширение его я-системы, что в свою очередь приводит кбатохромному сдвигу в спектрах белка [19]. В большинстве белков,характеризующихся поглощением и эмиссией света в красной и дальне-краснойобласти спектра (550 - 650 нм), расширение л-системы "зеленого" хромофораосуществляется за счёт ацилиминной группы [20].8Красные флуоресцентные белки (RFP) представляют значительный интересдля современной клеточной биологии и биотехнологии, поскольку вместе сголубыми, зелеными и жёлтыми позволяют одновременно вводить разноцветныефлуоресцентные метки в различные белки-мишени. Кроме того, в отличие от прочихGFP-подобпых белков, при работе с красными флуоресцентными белками вкладавтофлуоресценции клетки минимален. Также стоит отметить, что ткани животныхнаиболее прозрачны в дальпе-красном и инфракрасном диапазоне (650 - 900 нм),поэтому белки, обладающие эмиссией в этой области спектра, позволили бы изучатьпроцессы в рамках целого организма [2]. Очевидно, что информация о структурехромофора красньк флуоресцентных белков и механизме посттрансляционныхмодификаций, приводящих к батохромному сдвигу, имеет большое значение как длясоздания новых генетически кодируемых внутриклеточньк флуоресцентных меток,так и для улучшения свойств уже существующих.Среди всех известных красных флуоресцентных белков, особыйфундаментальный интерес представляет красный флуоресцентный белок из Zoanthussp.2 (z2FP574). Во-первых, следует отметить, что среди флуоресцентных белков изкораллового полипа рода Zoanthus встречаются представители трех цветовых групп:зеленой, желтой и красной, причем степень гомологии между ними составляет более80%. Во-вторых, принадлежность к той или иной спектральной группе жесткосвязана с характером первого а.к.о. хромофоробразующей X-Tyr-Glyпоследовательности. Так в желтом флуоресцентном белке необходимымтребованием является присутствие Lys в позиции X. В красном же белке из Zoanthussp.2 в этой позиции необходим остаток аспарагиновой кислоты. Интересно, что вэтом белке на промежуточной стадии созревания образуется зеленая флуоресцентнаяформа [21].9В настоящей работе проведено изучение химических основ снектральныхпревращений флуоресцентных белков из коралловых полипов рода Zoanthus. Приисследовании структуры хромофора z2FP574 была обнаружена новаяпосттрансляционная модификация, приводящяя к образованию краснойфлуоресцентной формы белка. С помощью мутагенеза удалось замедлить реакциисинтеза хромофора и изучить промежуточные продукты. Структурный анализхромофоров промежуточных форм, а также ряда мутантов флуоресцентных белковиз коралловых полипов позволили предложить механизм, по которому происходитпревращение из зеленого флуоресцентного состояния в красное.
