Главная » 2014 » Июль » 17 » Скачать Экспериментальный анализ механизма старения животных с помощью ионизирующей радиации и модификации ДНК 5-бром-2-дезоксиуридином. бесплатно
2:08 AM
Скачать Экспериментальный анализ механизма старения животных с помощью ионизирующей радиации и модификации ДНК 5-бром-2-дезоксиуридином. бесплатно
Экспериментальный анализ механизма старения животных с помощью ионизирующей радиации и модификации ДНК 5-бром-2'-дезоксиуридином
Диссертация
Автор: Потапенко, Андрей Игоревич
Название: Экспериментальный анализ механизма старения животных с помощью ионизирующей радиации и модификации ДНК 5-бром-2'-дезоксиуридином
Справка: Потапенко, Андрей Игоревич. Экспериментальный анализ механизма старения животных с помощью ионизирующей радиации и модификации ДНК 5-бром-2'-дезоксиуридином : диссертация кандидата биологических наук : 03.00.01 Москва, 1999 138 c. : 71 00-3/86
Объем: 138 стр.
Информация: Москва, 1999
Содержание:
Условные сокращения
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
1 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
11 Основные характеристики старения животных
111 Определение старения
12 Особенности феноменологии старения
121 Всеобщность среди эукариот
122 Динамика смертности организмов
123 О потенциальном бессмертии зародышевых клеток
124 Видоспецифичность средней продолжительности жизни
125 Корреляция ПЖ с эффективностью работы систем репарации ДНК
126 О влиянии искусственного отбора на ПЖ
127 Влияние генотипа на ПЖ
128 Анализ вариации индивидуальной ПЖ в популяциях и СПЖ популяции от поколения к поколению
129 Надежность механизма старения
1210 Возникновение и эволюция процесса старения
13 Проблема молекулярного и клеточного инициального субстрата старения
131 ДНК и старение
132 Нервные клетки и старение
14 Некоторые гипотезы о механизмах старения
15 Радиация и старение
16 Биологическое действие 5-бром-2"-дезоксиуридина
161 Действие БУДР на дрозофилу
162 Радиосенсибилизирующее действие БУДР
17 Общие вопросы теории старения
2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
21 Содержание дрозофил (контрольных, на БУДР, облученных)
22 Анализ кривых выживания
23 Исследование поведения дрозофил
24 Содержание и облучение мышей
25 Выделение и исследование ДНК
3 РЕЗУЛЬТАТЫ
31 Исследования на дрозофиле
311 Кривые выживания интактных насекомых
312 Кривые выживания дрозофил линий НА и ВА
313 Действие облучения на ПЖ Dmelanogaster
314 Влияние БУДР на развитие и ПЖ дрозофилы
315 Совместное действие БУДР и облучения на ПЖ дрозофилы
316 Влияние БУДР на поведение дрозофил
317 Действие облучения на фотоактивность дрозофил
32 Исследования на мышах
321 Действие облучения на ДНК соматических клеток
322 Проблема биологического возраста в исследовании старения
4 ОБСУЖДЕНИЕ
41 Молекулярный субстрат старения животных ядерная ДНК
42 Потенциальная фаза старения
43 Повреждения ДНК
44 Клеточный субстрат старения - нейроны
45 Возможная роль транспозонов в процессе старения
46 Генетическая детерминированность ПЖ у молодых насекомых
47 Теория этапности старения и проблема вымирания видов
5 ВЫВОДЫ
Введение:
Актуальность проблемы. Старение животных относится к числу фундаментальных признаков их онтогенеза. Старение гарантирует смерть организма и, следовательно, обеспечивает одно из главных свойств живой материи -ее дискретность во времени.
В настоящее время биология старения не занимает ведущих мест среди других биологических дисциплин. Такое положение во многом объясняется объективными трудностями, которые необходимо преодолевать исследователям. Главная из них состоит в том, что при старении изменяются многие структуры и функции организма и поэтому трудно определить, что же является клеточным и молекулярным инициальным субстратом старения. Кроме того на сам процесс старения, в частности на его скорость, оказывают влияние многие гены и факторы среды /7/. Отсюда проистекает и обилие различных гипотез (их десятки, а может быть, и сотни) о природе старения. Большинство таких гипотез может быть легко опровергнуто в ходе самых предварительных дискуссий и поэтому не нуждается в экспериментальном обосновании.
Между тем четкое представление о том, что же в действительности служит инициальным субстратом старения, абсолютно необходимо для того, чтобы биология старения перешла на уровень современной молекулярной биологии.
С нашей точки зрения исходной позицией при анализе старения животных должна быть опора на тот факт /3/, что динамика смертности таких разных представителей животного царства как насекомые (дрозофила) и млекопитающие (мышь, человек), проявляющаяся в форме кривых выживания (представленных в универсальном масштабе, т.е. когда средняя продолжительность жизни принята за 1), поразительно сходна (рис.1) /15, 27/.Это возможно только при тождественности всех безразмерных параметров распределений, включая самый точный их них - коэффициент вариации. Отсюда следует, что в основе старения насекомых и млекопитающих лежит общий фундаментальный механизм.
Рисунок 1. Кривые выживания различных видов животных.
По оси абсцисс - время в условных единицах (СПЖ=1); по оси ординат
• доля живых особей. 1 -мыши линии СВА; 2 -дрозофила, самки; 3 -дрозофила, самцы; 4 и 5
• человек, женщины и мужчины.
Мы полагаем, что для анализа этого механизма методами молекулярной биологии на настоящем этапе должны быть проведены такие исследования, которые позволят максимально приблизиться к ответу на вопрос; в каких соматических клетках и в каких молекулах этих клеток инициируются процессы старения. В последние годы ряд авторов /92/ полагают, что такими клетками являются в первую очередь нейроны, а молекулами - ядерные ДНК. Однако оба эти предположения нуждаются в надежном экспериментальном обосновании, равно как и определение этапов старения.
Мощным инструментом анализа ряда биологических процессов, в том числе и старения, на протяжении уже многих лет служат ионизирующие излучения. Однако при использовании радиации в геронтологических исследованиях следует соблюдать определенную осторожность, в особенности, если речь идет о млекопитающих. У последних на динамику смертности может оказать решающее влияние развитие лучевой болезни, обусловленной поражением особо радиочувствительных митотических клеток. Поэтому фундаментальный механизм старения необходимо исследовать либо предотвращая лучевую болезнь (например, облучением головы крыс или мышей при экранировании остальных частей тела), либо используя в качестве объектов исследования организмы, соматические ткани которых состоят из постмитотических клеток, в частности, насекомых. Среди последних ведущую роль играет Drosophila melanogaster, которая на протяжении многих лет остается одним из главных объектов не только генетики, но и биологии развития и радиобиологии.
Указанный круг проблем определил цели и задачи настоящей работы.
Цели и задачи исследования. Основной целью настоящей работы было изучение кинетики старения организма и функционального состояния клеток нервных ганглиев у Drosophila meianogaster в норме, при действии ионизирующего излучения, модификации ДНК аналогом тимина 5-бромурацилом (5-БУ) (использованным в виде нуклеозида 5-бром-2'- дезоксиуридина - БУДР), и их совместном действии. Функциональное состояние нервных клеток оценивали по поведению насекомых.
Ценность 5-БУ как инструмента анализа генома заключается в двух его свойствах: во-первых, он служит уникальными радиосенсибилизатором, действие которого специфически опосредовано через ДНК, поскольку в какие-либо другие макромолекулы клетки этот аналог не включается /29/; во-вторых, 5-БУ, присутствуя в ДНК, обратимо, немутационным путем подавляет экспрессию многих тканеспецифических генов, не оказывая существенного влияния на гены "домашнего хозяйства" /194/.
Важной особенностью онтогенеза дрозофилы является полный метаморфоз, причем известно, что клетки нервных ганглиев проходят последний ми-тотический цикл в личиночном периоде, в то время как клетки имагинальных дисков активно делятся и дифференцируются на стадии куколки. Поэтому БУДР, включившийся во время фазы синтеза ДНК у личинок в ядра нейронов, в полном объеме у взрослых насекомых может сохраниться только в этих клетках.
Часть нашей работы (меньшая по объему), посвященная исследованию повреждений ДНК, чувствительных к нуклеазе S1, выполнена на мышах. В опытах по облучению, чтобы изучать радиационное укорочение продолжительности жизни (РИУЖ) в отсутствии лучевой болезни, облучали только головы мышей, экранируя тело.
Конкретные задачи исследования состояли в следующем.
1. Изучить и дать математический метод сравнения кривых выживания D.melanogaster в норме и при облучении гамма-квантами в дозах до 1000 Гр.
2. Оценить, в какой степени модель РИУЖ отражает процесс нормального старения насекомых.
3. Исследовать по характеру кривых выживания влияние инкубации личинок D.melanogaster с БУДР на процесс старения и продолжительность жизни взрослых особей.
4. Определить, происходит ли радиосенсибилизация 5-БУ, включенным в личиночной стадии, по тесту продолжительности жизни имаго.
5. Изучить влияние 5-БУ как агента, подавляющего функции тканеспе-цифических генов, на фотоактивность взрослых насекомых в зависимости от концентрации его в среде выращивания личинок.
6. Исследовать влияние ионизирующей радиации на фотоактивность дрозофил.
7. Изучить связь между фотоактивностью насекомых и продолжительностью предстоящей жизни в норме, при действии облучения и БУДР.
8. Изучить влияние облучения головного мозга мышей на продолжительность жизни.
9. Определить количество дефектов ДНК, чувствительных к нуклеазе S1, в клетках печени и мозга у нормальных мышей разного возраста, а также у животных после облучения головы.
10.Для трактовки полученных данных пересмотреть концепцию биологического возраста.
11. Изучить кинетику смертности у дрозофил линий НА и ВА /19/, отличающихся количеством и характером расположения по геному некоторых мобильных генетических элементов.
Научная новизна и практическая значимость работы.
На D.melanogaster получены и интерпретированы новые данные, касающиеся естественного старения (ЕС) и РИУЖ. В пределах доз до 500 Гр кинетика смертности насекомых при ЕС и РИУЖ не отличается. Следовательно, в этих случаях РИУЖ служит адекватной моделью ЕС.
Установлено, что плато на кривых выживания является фундаментальным признаком онтогенеза дрозофилы.
Впервые с помощью классического метода радиобиологии - сенсибилизации 5-бромурацилом доказано, что инициальным субстратом старения у дрозофилы является ДНК нервных клеток.
На основании полученных результатов предложена концепция этапности старения, согласно которой, как ЕС, так и РИУЖ имеют две фазы: потенциальную, минимальное время которой соответствует продолжительности плато на кривых выживания, и фазу реализации. Существенным моментом последней является выключение специфических функций нервных клеток. Последнее впервые показано на примере резкого ослабления фотоактивности D. melano-gaster при частичном замещении тимина ядерной ДНК на 5-БУ и действии больших доз ионизирующей радиации.
Установлено, что фотоактивность служит одним из показателей, определяющих продолжительность предстоящей жизни.
На мышах показано, что при ЕС и РИУЖ, вызванным облучением головного мозга, наблюдается спустя значительный промежуток времени увеличение числа участков ДНК, чувствительных к нуклеазе S1, причем эти участки в отличие от первичных повреждений имеют тенденцию располагаться в последовательностях, обогащенных АТ-парами.
Впервые изучена ПЖ на линиях НА и ВА D.melanogaster, полученных Л.З.Кайдановым, различающихся по количеству и локализации ряда мобильных генетических элементов. У насекомых линии НА, для которой характерна низкая половая активность самцов и множество других патологических сдвигов, наблюдающихся при хромосомных болезнях человека, резко снижена СПЖ.
Разработана новая концепция биологического возраста животных, согласно которой для его определения могут служить слабо скоррелированные с календарным возрастом (KB), или вовсе не скоррелированные с последним параметры организма.
Результаты, полученные в настоящей работе, послужившие основой для формулирования концепции этапности старения (нормального и индуцированного радиацией) и заключения о том, что ДНК нервных клеток является инициальным субстратом старения открывают новое направление в теории старения, научно обосновывающее переход этой области биологии на уровень молекулярных исследований.
Основные положения.выносимые на защиту.
1. Критерий соответствия исследуемых процессов ЕС - форма кривых выживания (динамика смертности). Определение условий, при которых РИУЖ может быть адекватной моделью ЕС на дрозофиле в соответствие с предложенным критерием.
2. Доказательство инициальной роли именно ДНК нервных клеток дрозофилы в развитии РИУЖ и ЕС.
3. Формулирование концепции этапности ЕС и РИУЖ; выделение потенциальной и терминальной фаз старения.
4. Терминальной фазе старения предшествует резкое снижение фотоактивности - одного из проявлений функций тканеспецифических генов нервных клеток.
5. В начале терминальной фазы ЕС и РИУЖ в постмитотических клетках мышей появляются и накапливаются дефекты вторичной структуры ДНК, причем, в отличие от расположенных случайным образом первичных радиацион-но индуцированных дефектов, старческие изменения ДНК локализованы в АТ-богатых районах.
6. Разработана новая концепция биологического возраста животных, согласно которой для его определения могут служить слабо скоррелированные с KB, или вовсе не скоррелированные с последним параметры организма.
Проведенное радиобиологическое исследование старения у дрозофилы и мышей открывает новое направление в постановке и разработке конкретных задач для молекулярно - биологических исследований общих механизмов старения животных.
Апробация работы и публикации.
Материалы работы доложены на l-ом Всесоюзном симпозиуме "Искусственное увеличение видовой продолжительности жизни". Москва, 1978, всесоюзном симпозиуме "Молекулярные и клеточные механизмы старения". Киев, 1981, V Всесоюзном съезде геронтологов и гериаторов, Тбилиси, 1988, I Всесоюзном съезде радиобиологов, Москва, 1988, Всероссийской учредительной конференции геронтологов и гериаторов, Санкт-Петербург 1994, проблемной конференции "Старение и долголетие: системный и междисциплинарный подходы", Москва, 1977, I Всероссийском съезде радиобиологов, Москва, 1998,и др., а также на отдельских и институтских семинарах Института общей генетики РАН, Института химической физики РАН, Московского инженерно-физического института, сессиях МОИП, научных конкурсах ИХФ РАН.
Основные результаты диссертационной работы изложены в 29 публикациях.
Диссертация состоит из разделов: общая характеристика работы, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение, заключения, выводов и списка литературы. Общий объем -139 стр.
